Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial
Summary
Este protocolo describe un modelo in vitro fiable y eficiente de la barrera hematoencefálica. El método utiliza células endoteliales vasculares cerebrales de ratón bEnd.3 y mide la resistencia eléctrica transmembrana.
Abstract
La barrera hematoencefálica (BHE) es una estructura fisiológica dinámica compuesta por células endoteliales microvasculares, astrocitos y pericitos. Al coordinar la interacción entre el tránsito restringido de sustancias nocivas, la absorción de nutrientes y la eliminación de metabolitos en el cerebro, la BHE es esencial para preservar la homeostasis del sistema nervioso central. La construcción de modelos in vitro de la BHE es una herramienta valiosa para explorar la fisiopatología de los trastornos neurológicos y crear tratamientos farmacológicos. Este estudio describe un procedimiento para crear un modelo de células BBB monocapa in vitro mediante la siembra de células bEnd.3 en la cámara superior de una placa de 24 pocillos. Para evaluar la integridad de la función de barrera celular, se utilizó el voltímetro de celda epitelial convencional para registrar la resistencia eléctrica transmembrana de las células normales y las células hipóxicas inducidas por CoCl2 en tiempo real. Anticipamos que los experimentos anteriores proporcionarán ideas efectivas para la creación de modelos in vitro de BHE y medicamentos para tratar trastornos de enfermedades del sistema nervioso central.
Introduction
La BHE es una interfaz biológica única entre la circulación sanguínea y el tejido nervioso, que está compuesta por células endoteliales vasculares, pericitos, astrocitos, neuronas yotras estructuras celulares. El flujo de iones, sustancias químicas y células entre la sangre y el cerebro está estrictamente regulado por esta barrera. Esta homeostasis protege los tejidos nerviosos contra toxinas y patógenos, al tiempo que permite el funcionamiento adecuado de los nervios del cerebro 2,3. Mantener la integridad de la BHE puede prevenir eficazmente el desarrollo y la progresión de trastornos que afectan al sistema nervioso central, como la disfunción neuronal, el edema y la neuroinflamación. Sin embargo, las propiedades fisiológicas únicas de la BHE impiden que más del 98% de los medicamentos de moléculas pequeñas y el 100% de los productos farmacéuticos macromoleculares entren enel sistema nervioso central. Por lo tanto, el aumento de la penetración de los medicamentos a través de la BHE durante el desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central es esencial para alcanzar la eficacia terapéutica 6,7. A pesar de que el cribado por simulación informática de sustratos ha aumentado significativamente la probabilidad de que los candidatos a fármacos crucen la barrera hematoencefálica, todavía se necesitan modelos fiables y asequibles in vitro/in vivo de la BHE para satisfacer las necesidades de la investigación científica8.
Una técnica rápida y asequible para el cribado de fármacos de alto rendimiento es el modelo in vitro 9. Para arrojar luz sobre los procesos fundamentales de los efectos de los medicamentos sobre la función de la BHE y su papel en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, se han creado una serie de modelos simplificados de BHE in vitro. En la actualidad, los modelos más comunes de BHE in vitro son los modelos monocapa, cocultivo, dinámico y microfluídico 10,11,12, construidos por células endoteliales vasculares y astrocitos, pericitos o microglía 13,14. Aunque los cultivos celulares 3D están más en línea con la estructura fisiológica de la barrera hematoencefálica15, su aplicación como medio de detección de fármacos para la barrera hematoencefálica sigue estando limitada por su intrincado diseño y su deficiente reproducibilidad. Por el contrario, el modelo monocapa in vitro es el más utilizado para investigar la BHE y es aplicable para determinar la expresión de transportadores de membrana y proteínas de unión estrecha en células particulares.
La medición de la resistencia eléctrica transmembrana (TEER) es una técnica para evaluar y monitorear la capa de células a través de la resistencia y evaluar la integridad celular y la permeabilidad de la barrera. Al insertar simultáneamente dos electrodos en el medio de crecimiento o en la solución tampón a cada lado de la monocapa, es posible medir la corriente alterna o la impedancia eléctrica a través de la capa compacta de la célula16,17. Con el fin de determinar si el modelo de BHE in vitro se ha creado correctamente, la medición de TEER se empleará generalmente como el estándar de oro18. Por otro lado, la tendencia de la acción de la medicación sobre la permeabilidad de la BHE puede predecirse con precisión midiendo el cambio en la resistencia eléctrica de la capa celular después de la afectación del fármaco19. Por ejemplo, Feng et al. descubrieron que el catalpol (el monómero activo primario de rehmanniae) podría revertir eficazmente la regulación a la baja inducida por lipopolisacáridos de las proteínas de unión estrecha en la BHE y aumentar el valor TEER de la capa20 de células endoteliales del cerebro de ratón.
La respuesta neuroinflamatoria suele ser la principal causa del desequilibrio de la homeostasis de la BHE21. El tratamiento hipóxico para inducir lesiones neuroinflamatorias es el principal método para destruir la barrera hematoencefálica, incluyendo principalmente métodos físicos y métodos de reactivos químicos. El primero utiliza principalmente una incubadora de tres gases para variar el contenido de oxígeno en el entorno de crecimiento celular para simular condiciones hipóxicas22, mientras que el segundo se logra mediante la introducción artificial de reactivos desoxi como el CoCl2 en el medio de cultivo celular23. Las células permanecerán en una condición desoxigenada si el Fe2+ se sustituye por Co2+ en el hemo. Si el Fe2+ es sustituido por el Co2+ en el grupo catalítico, la actividad de la prolina hidroxilasa y la aspartato hidroxilasa se inhibirá, lo que resultará en una acumulación del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α)24. Bajo hipoxia persistente, la desfosforilación de HIF-1α en el citoplasma desencadena la muerte celular y activa el factor de crecimiento endotelial vascular, lo que en última instancia aumenta la permeabilidad vascular. En estudios previos25,26, se ha demostrado que la hipoxia puede reducir significativamente la expresión de proteínas de unión estrecha endotelial para aumentar la permeabilidad de la BHE. En este estudio, se midió la curva de resistencia temporal de las células bEnd.3 sembradas en placas de 24 pocillos para crear un modelo BBB sencillo. Utilizando este modelo, caracterizamos los cambios en el TEER celular después de la intervención con CoCl2 con el fin de construir un modelo celular que pueda utilizarse para detectar fármacos para la protección de la BHE.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cerebro, uno de los órganos corporales más desarrollados, controla una amplia gama de intrincados procesos fisiológicos, como la memoria, la cognición, la audición, el olfato yel movimiento. El cerebro es uno de los órganos más complicados y enfermos del cuerpo humano al mismo tiempo. La aparición de muchos trastornos del sistema nervioso central muestra una tendencia creciente año tras año debido a factores como la contaminación del aire, los patrones de alimentación irregulares y …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274207 y 82104533), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012) y el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de MTC de Chengdu (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
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