Krystallisering og in situ rumtemperatur dataindsamling ved hjælp af krystalliseringsanlægget på Harwell og Beamline VMXi, Diamond Light Source

Summary

Vi præsenterer en protokol for krystallisering af proteiner ved hjælp af krystalliseringsfaciliteten i forskningskomplekset i Harwell og efterfølgende in situ røntgenkrystallografisk dataindsamling fra krystaller i pladerne ved Diamonds Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) strålelinje. Vi beskriver prøvekrav, krystalliseringsprotokoller og retningslinjer for dataindsamling.

Abstract

Protokoller for robotproteinkrystallisering ved hjælp af krystalliseringsanlægget i Harwell og in situ rumtemperaturdataindsamling fra krystalliseringsplader ved Diamond Light Source beamline VMXi er beskrevet. Denne fremgangsmåde gør det muligt at bestemme krystalstrukturer ved stuetemperatur af høj kvalitet ud fra flere krystaller på en ligetil måde og giver meget hurtig feedback på resultaterne af krystalliseringsforsøg samt muliggør seriel krystallografi. Værdien af rumtemperaturstrukturer til forståelse af proteinstruktur, ligandbinding og dynamik bliver i stigende grad anerkendt i det strukturelle biologiske samfund. Denne pipeline er tilgængelig for brugere fra hele verden med flere tilgængelige adgangsformer. Krystalliseringseksperimenter, der er konfigureret, kan afbildes og ses eksternt med krystaller, der identificeres automatisk ved hjælp af et maskinlæringsværktøj. Data måles i et købaseret system med op til 60° rotationsdatasæt fra brugervalgte krystaller i en plade. Data fra alle krystaller inden for en bestemt brønd eller prøvegruppe flettes automatisk ved hjælp af xia2.multiplex med output, der er ligetil adgang til via en webbrowsergrænseflade.

Introduction

Røntgenkrystallografi er fortsat et vigtigt redskab til forståelse af proteiners struktur og funktion, idet det giver højopløselige strukturer af proteiner eller deres komplekser med for eksempel substrater eller lægemiddelkandidater. I mange tilfælde er opnåelse af krystaller med ønskelige egenskaber - stærkt diffrakterende, krystalform, der kan blødgøres og uden krystalpatologier såsom twinning - imidlertid en betydelig flaskehals¹. Da egnede kemiske forhold til fremstilling af proteinkrystaller generelt ikke kan forudsiges, er krystalliseringsscreening, der udforsker tusindvis af potentielle kemiske blandinger, standard, ofte hjulpet af automatisering / robotik til indstilling af skærme og krystalhoteller til overvågning, ofte eksternt, krystalliseringsdråbebilleder, der optages.

Når krystaller vises, skal de typisk høstes fra krystalliseringsmiljøet ved hjælp af en nylon- eller Kapton-løkke og derefter overføres til en dråbe indeholdende et kryoprotektionsmiddel (hvis søgning er en yderligere variabel), før de falder ned i frysning i flydende nitrogen. Disse yderligere trin mellem krystallisering og røntgendataindsamling kan involvere dehydrering af krystallisationsdråben, når dens forseglede miljø er brudt, mekaniske belastninger på krystallen, når den håndteres, og beskadigelse fra kryoprotektionsmidlerne til krystalgitteret (hvilket typisk resulterer i øget mosaikspredning) blandt andre faktorer². Derudover er krystalhøstning tids- og arbejdskrævende og kan føre til inhomogenitet mellem prøver, især når der dannes hud på dråber under høstprocessen. VMXi-strålelinjen giver adgang til brugbare data fra krystaller, der sidder fast på pladen, som ellers ville blive kasseret til dataindsamling.

Langt de fleste røntgenkrystalstrukturer bestemmes ved 100K ved hjælp af ovenstående tilgang, hvilket muliggør enkel krystaltransport og håndtering og øger krystallevetiden i røntgenstrålen med størrelsesordener. Der er imidlertid stigende interesse for at bestemme strukturer under ikke-kryogene forhold, det vil sige meget tættere på de fysiologiske forhold, der er relevante for proteinfunktion ^2,3,4. Dette muliggør en meget bedre forståelse af proteiners dynamiske struktur, undgår aminosyrekonformationer eller sløjfer, der fryses ud i funktionelt ikke-relevante tilstande⁵, og gør det muligt at udforske ligandbinding under forhold, der er meget tættere på dem i proteinets naturlige miljø i cellen og organismen⁶.

En alternativ tilgang, implementeret ved Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) strålelinjen ved Diamond Light Source synkrotronen, UK, er at måle diffraktionsdataene direkte fra krystaller i det miljø, hvor de er vokset (dvs. inden for krystallisationspladen), under omgivende forhold og uden forstyrrelse ^7,8. Dette muliggør meget hurtig feedback fra krystalliseringsskærme og optimeringer for at guide en bruger til en optimal krystalform til deres behov. Det gør det også muligt at fremstille rumtemperaturstrukturer af høj kvalitet på en automatiseret måde⁹.

Denne protokol forudsætter, at en bruger har en meget ren proteinprøve klar til krystallisering. Vi beskriver brugeroplevelsen ved at få adgang til krystalliseringsfaciliteten i Harwell for at producere proteinkrystaller og derefter bruge beamline VMXi til dataindsamling (figur 1).

Krystalliseringsanlægget i Harwell

Krystalliseringsanlægget i Harwell (CF) er placeret i forskningskomplekset i Harwell (RCaH) ved siden af Diamond Light Source. Anlægget tilbyder brugerne et automatiseret laboratorium med høj kapacitet til makromolekylær krystallisering ved hjælp af robotik til krystalliseringsscreening, krystaloptimering, krystalbilleddannelse og karakterisering. Gennem tæt integration med den højt automatiserede VMXi-strålelinje har tempoet i bestemmelsen af rumtemperaturstrukturer accelereret kraftigt og muliggør karakterisering af nye proteinstrukturer, proteinligand- og DNA-ligandkomplekser samt automatiseret fragmentscreening (figur 1), alt sammen under ikke-kryogene forhold.

CF-rørledningen er en række instrumenter, der omfatter nanoliters krystallisationsrobotter⁹ til krystallisation af opløselige proteiner og membranproteiner, væskehåndteringsrobotter til forberedelse af kommercielle krystalliseringsskærme og komplekse brugerdefinerede optimeringsskærme og fire billeddannelsesinstrumenter (et ved 4 °C og tre ved 20 °C til billeddannelse af krystalliseringsplader (se materialetabellen). Et billeddannere er i stand til at afbilde lipidkubikfaseglasplader (LCP), og et billeddannere er udstyret med multifluorescensoptik (begge ved 20 °C).

Anlægget bruges nu bredt af et bredt spektrum af akademiske og industrielle brugere, herunder Membrane Protein Laboratory (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem fragment screening facilitet ¹⁰, MX beamlines, XFEL-hub, samt Rosalind Franklin Institute (RFI). Denne veletablerede og optimerede pipeline har gjort det muligt at udføre krystalliseringseksperimenter på tværs af et bredt spektrum af strukturbiologiske projekter. Dette papir beskriver rørledningen for krystaller beregnet til dataindsamling på VMXi, selvom krystaller også kan høstes og kryokøles eller ledes til XChem-rørledningen.

Brugeradgang tildeles via Diamond MX-forslagssystemet (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html), og industrielle brugere understøttes gennem Diamond Industry Liaison Group. Alle brugere kan komme til stedet med deres prøve (er) eller plader, som kan transporteres manuelt. Det anbefales ikke at sende plader med kurer, da vores erfaring tyder på, at dråber kan bevæge sig væk fra det sted, hvor de blev dispenseret, eller dråber kan blive beskadiget af krystallisationsbeholderen. Alternativt kan brugerne efter aftale sende deres proteinprøver til CF, hvor medarbejdere opretter krystalliseringseksperimenter på deres vegne. Eksperimenterne kan fjernovervåges af brugeren ved enten at logge på Rock Maker Web i tilfælde af CF eller via ISPyB i tilfælde af VMXi. Adgang til CF kan udføres på en iterativ måde baseret på røntgendiffraktionsresultaterne indsamlet hos Diamond.

Beamline VMXi på Diamond Light Source

Beamline VMXi (i det følgende benævnt "beamline") er et unikt og nyudviklet instrument, der er fuldt dedikeret til højautomatiseret røntgenkrystallografi ved stuetemperatur med fokus på måling af data fra krystaller i egnede krystalliseringsplader. Strålelinjen tilbyder et mikrofokus (10 x 10 μm), lyserød stråle (båndpas på <5 × ^10-2ΔE / E) med en høj flux på ~ 2 × 10¹³ fotoner / s (ved 16 KeV)⁷. Denne højfluxstråle kombineret med en hurtig detektor muliggør meget høj gennemstrømning af prøver og indsamling af data fra prøver op til 10 μm i størrelse.

Krystalliseringsplader kommer ind i strålelinjen ved at blive gemt i et prøvelagringssystem og afbildet baseret på den tidsplan, som brugeren leverer, mens han registrerer pladerne ved hjælp af ISPyB^{11-grænsefladen} SynchWeb¹². Typisk rådes brugerne til at vælge en Fibonacci-sekvens af tidspunkter til billeddannelse (0, 12, 24, 36, 60... 7.320 timer fra pladen er kommet ind i systemet). Brugeren informeres via e-mail, når en plade er blevet afbildet. Både synligt lys og UV-lysbilleder er tilgængelige for brugere efter behov. De billeder, der tages af prøvelagringssystemet, analyseres af en maskinlæringsalgoritme; Dette lokaliserer og definerer automatisk interessepunkter for objekter, der ligner krystaller, og registrerer de interessepunkter, der er klar til, at brugeren kan føje til en kø til dataindsamling. Brugere kan også manuelt klikke på billederne i synligt lys for at registrere interessepunkter eller kan klikke og trække en region, der skal analyseres ved rasterscanning. Disse punkter er tilgængelige for brugere at tilføje til køen sammen med de automatisk placerede punkter.

Når alle prøver har passende parametre til dataindsamling, kommer pladen ind i en kø. Når pladen når toppen af køen, dispenseres den automatisk til strålelinjen. Krystalliseringspladerne indlæses automatisk fra krystalhotellerne i strålelinjen af en robotarm, og efter billedmatchning måles krystallografiske datasæt på op til 60 ° rotation fra hver valgt krystal i henhold til brugerdefinerede instruktioner. Alle dråber i en plade kan bruges til disse eksperimenter på strålelinjen. Data flettes fra flere krystaller for at producere isomorfe, optimalt fusionerede datasæt på en automatiseret måde ^7,9. Når alle datasæt i kø er indsamlet, får brugeren tilsendt en e-mail med et link, der skal følges for at få vist datasættene i ISPyB¹¹, som i andre Diamond MX-strålelinjer. Brugere dirigeres også til beamline-websiden (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Fremstilling af krystaller i in situ-plader ved hjælp af krystalliseringsanlægget i Harwell

BEMÆRK: Adgang til CF understøttes af en række forskellige ruter og afhænger af projektets anvendelse og brugertype (akademisk eller industri). XChem- og MPL-projekter har deres eget ansøgningssystem via brugeradministrationssystemet (UAS) og kan indsendes enten via standardadgangsruten (herunder iNEXT Discovery og EUbOPEN) eller BAG Access. Protokollen nedenfor er specifik for VMXi-brugere.

1. Indsendelse af forslag og forberedelse af besøget
   1. Angiv oplysninger om projektet til en BAG-forslagsansøgning, eller føj dem til et aktivt BAG-forslag. Der er normalt en BAG-koordinator, der organiserer papirarbejdet. Alternativt kan du indsende et forslag om hurtig adgang til strålelinjen.
   2. Sørg for, at prøven er blevet registreret og sikkerhedsvalideret i UAS på et forslag inden ankomst på stedet enten med kurer eller personligt.
   3. Sørg for, at brugeren er registreret (med FedID og adgangskode).
   4. Sørg for, at brugeren er blevet føjet til et MX-forslag som associeret i UAS af BAG-koordinatoren.
   5. Udfyld formularen til specifikationsdetaljer for strålelinjekrystallisation, og send formularen til VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Kommuniker med beamline-personalet om eksperimentkravene og beamline-tilgængeligheden.
   7. Hvis der sendes proteinprøver, skal prøverne kun sendes efter forudgående aftale. Se afsnit 1.2 for detaljer.
   8. Hvis brugeren skal komme ind på stedet for at opsætte krystalliseringsplader i CF, skal du tjekke med facilitetspersonalet, om der er et tidsrum til rådighed til at bruge facilitetsinstrumenteringen og følge afsnit 1.2.1.
   9. Hvis brugeren bringer plader ind på stedet, skal du sikre dig, at prøven dispenseres i den korrekte pladetype og placere krystalliseringsdråberne på det rigtige sted og den korrekte mængde. Følg afsnit 1.2.2. Strålelinjen accepterer kun specifikke in situ-krystalliseringsplader (Greiner CrystalQuickX og MiTeGen In Situ-1); Sørg for, at dråberne ikke er større end 200 nL.
2. Krystallisationseksperiment udført i CF
   BEMÆRK: Anlægget tilbyder en række makromolekylære krystalliseringsmetoder med høj kapacitet såsom dampdiffusion samt batchkrystallisation under olie og LCP. Det anbefales at starte med 70-100 μL rent protein og udføre dampdiffusionsforsøg for opløselige proteiner med tre skærme ved hjælp af et forhold på 100 nL proteinopløsning og 100 nL krystallisationsbeholderopløsning og inkubation af pladerne ved 20 °C. En række kommercielle skærme er tilgængelige inden for anlægget. Fugtighed og temperaturregulering fås med de mest anvendte 4 °C og 20 °C. Brugere, der besøger CF, modtager standardiseret træning og support til betjening af krystalliseringsinstrumenteringen og vil bruge indstillingerne beskrevet heri.
   1. Forsendelsesprøver til opsætning hos CF
      BEMÆRK: Før ankomst til stedet skal proteinprøven være valideret på et forslag inden for UAS-systemet. Når proteinprøven er ankommet til stedet, vil medarbejderne oprette krystalliseringseksperimenter som beskrevet i tidligere kommunikation med brugeren. Bekræftelse vil blive sendt via e-mail med stregkodeoplysninger for de eksperimentelle krystallisationsplader. Brugeren vil blive bedt om at tilføje krystalliseringspladerne som beholdere til det relevante forslag. Når dette er gjort, kan pladerne opbevares i automatiserede billeddannere i krystalliseringsanlægget eller ved strålelinjen. ISPyB vil være grænsefladen, der bruges til interaktion ved strålelinjen.
      1. Der tilvejebringes proteinprøveopløsningen i koncentrationen til krystallisation i multipla af 25 μL alikvoter. Mærk tydeligt prøveglassene, der indeholder proteinprøven.
      2. Giv om nødvendigt en proteinbufferopløsning, ligandopløsning eller reservoiropløsning.
      3. Informer facilitetspersonalet om, hvilke skærme og faldforhold der skal bruges.
   2. Indstillinger for krystalliseringsplade
      BEMÆRK: Vi kræver, at krystalliseringsdråberne i Greiner CrystalQuickX og MiTeGen In Situ-1-pladen er på et bestemt sted; plader, der er sat op andetsteds, skal bruge følgende Mosquito^{13-indstillinger} beskrevet her.
      1. For at justere pladedefinitionen for MiTeGen In Situ-1 skal du åbne Mosquito SPT-softwaren og klikke på standardsiden MiTeGen In Situ-1-pladedefinition ved at klikke på Opsætning | 96 Nå | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 dråber) (figur 2A). Klik på redigeringsknappen, og rediger værdierne for underhul 2-placering: X-forskydning til - 1,2 og Y-forskydning til 1,8 og for underbrønd 3-placering: X-forskydning til 1,3 og Y-forskydning til 1,8 (figur 2B,C).
      2. For at justere pladedefinitionen for Greiner CrystalQuickX skal du åbne Mosquito SPT-softwaren og klikke på standardsiden Greiner CrystalQuickX-pladedefinition ved at klikke på Opsætning | 96 Nå | Greiner CrystalQuickX (figur 2D). Klik på redigeringsknappen , og rediger værdierne for underbrønd 1-placering: X-forskydning til - 1,95 og Y-forskydning til 1,45 og for underbrønd 2-placering: X-forskydning til 1,95 og Y-forskydning til 1,45 (figur 2E,F).

2. Brug af strålelinjen ved Diamond Light Source

BEMÆRK: Al interaktion med beamline af brugere udføres eksternt ved hjælp af ISPyB^{11-grænsefladen} . Der kræves ingen fysisk tilstedeværelse ved strålelinjen, og data indsamles ved hjælp af et købaseret system i stedet for at blive planlagt på et bestemt tidspunkt. Brugere vil have et forslag knyttet til deres Diamond Light Source adgang. Ved strålelinjen tildeles hver krystalliseringsplade et unikt besøg og defineres som en 'beholder' inden for ISPyB¹¹ svarende til en puck, der indeholder prøver ved 100 K. Optimeringsskærme kan ikke oprettes ved hjælp af SynchWeb-grænsefladen, og som sådan tilføjes information typisk i kommentarfeltet (se trin 2.1.4.). Den person, der registrerer pladen, skal kontrollere e-mail-adressen, da pladeejeren modtager e-mails vedrørende billedbehandling samt meddelelser om pladeudfyldte.

1. Registrering af plader
   1. Log ind på ISPyB med et passende Diamond FedID, og vælg Forslag. Søg efter forslaget af interesse ved at rulle eller skrive forslagsnummeret i søgefeltet. Vælg Forsendelse i rullemenuen under forslagsnummeret (figur 3A), som åbner vinduet Forsendelser med forsendelser i det pågældende forslag. Klik på +Tilføj forsendelse øverst til højre (Figur 3B) for at åbne vinduet Tilføj ny forsendelse , giv forsendelsen et navn, klik på Automatiseret/Imager, og klik derefter på knappen Tilføj forsendelse nederst til venstre (Figur 3C).
   2. I forsendelsesvinduet (figur 3D) skal du klikke på +Tilføj container, som derefter viser sidevisningen Tilføj container (figur 3E). Vælg i rullemenuen Beholdertype en af de relevante pladetyper. Siden ændres, så den afspejler den valgte containertype. Indtast en stregkode og beholdernavn i henhold til e-mail-instruktioner fra beamline-personale, der er specifikke for forsøgspladerne. Bemærk, at der skelnes mellem store og små bogstaver.
   3. Vælg VMXi 20 °C imager i rullemenuen Anmodet billeddannelse , Fibonacci-billedbehandlingsplanen i rullemenuen Billedbehandlingsplan , krystalliseringsskærmen i rullemenuen Krystalliseringsskærm og brugernavnet i rullemenuen Ejer , klik på knappen Vis , og indtast den korrekte kontakt-e-mail-adresse i feltet E-mail (figur 3F).
   4. Indtast yderligere oplysninger om pladen i kommentarfeltet . Vælg den relevante prøve i rullemenuen Protein , og brug akronymet registreret i UAS og godkendt af Diamond i forsøgsforslaget. Indtast det samme navn i feltet Eksempelnavn ; Lad de resterende kasser være tomme.
   5. Klik på ikonet +Plade for at replikere prøven over hele pladen og udfylde hele beholderen med grønne firkanter. Klik på +Tilføj beholder nederst på siden for at registrere pladen. Bed en medarbejder ved strålelinjen om at overføre pladen til det relevante kamera, hvor den vil blive gemt og afbildet. Et besøg genereres, når beholderen er gemt i billeddannerne, og brugeren modtager en e-mail med et link til pladen og dens billeder.
2. Visning af billedresultater
   1. Gå til det relevante forslag (trin 2.1.1), vælg Containere i rullemenuen under forslagsnummeret, og hold øje med listen over tilgængelige containere for forslaget. Vælg filterpladerne, hvis der findes andre prøveholdertyper. Hvis du vil indsnævre søgningen yderligere, skal du markere afkrydsningsfeltet Mine containere for kun at få vist de mest relevante containere, der er knyttet til det aktuelle bruger-id, der er logget på. Klik på den relevante beholder ved at flytte markøren hen over den enkelte linje og venstreklikke med musen.
   2. Når du vælger beholderen, vises en ny visning, der viser en oversigt over pladen (figur 4A). Klik på en dråbe i pladerepræsentationen i venstre side af displayet for at vise det seneste billede fra den respektive dråbe. Brug piletasterne til at navigere mellem dråber, eller vælg individuelle dråber ved hjælp af en mus / markør.
   3. For at se historiske billeder af en dråbe skal du klikke på H-knappen og vente på, at et popup-galleri med billeder vises over det aktuelle brønddråbebillede. Hold markøren over de enkelte billeder for at opdatere hovedslipbilledet.
   4. Bedøm billeder for at angive status for hver dråbe ved at trykke på knapperne 0 - 9 . For at se de enkelte kategorier skal du åbne rullemenuen Score øverst til venstre på drop-billedet. Se efter blå kryds i hvert af dropbillederne, som er et resultat af en algoritme (CHiMP), der er trænet til at lede efter "krystaller" i billederne.
   5. Klik på den tredje ikonknap kaldet Mål øverst til højre på dropbilledet for at få adgang til et måleværktøj. For at bruge dette værktøj skal du klikke og trække en linje, og en lineal forlænges og giver afstanden i μm.
   6. Hvis du vil anmode om en ekstra billedsession, skal du klikke på enten Synlig eller UV på rullelisten ved siden af overskriften Handlinger nederst på siden. Klik derefter på knappen Anmod om billedbehandling af plade .
3. Valg af krystal/CHiMP
   1. Hvis du vil tilføje point til dataindsamling manuelt, skal du trykke på knappen +Markér punkt . Hold markøren over det ønskede interessepunkt, og vælg. Vent på, at et rødt kryds vises.
      BEMÆRK: Der kan oprettes op til 100 objekter pr. dråbe.
   2. Når alle punkter er markeret, skal du klikke på knappen +Udfør . Husk også at klikke på knappen +Udfør , før du prøver at måle objekter. Hvis du vil tilføje områder til dataindsamling via gitterscanninger, skal du klikke på knappen +Markér område . Klik på øverste venstre punkt , og træk ned og højre for at oprette et område, der scannes rasterscannet på strålelinjen. Som med punkter skal du klikke på knappen +Udfør , når alle ønskede regioner er oprettet.
      BEMÆRK: Det er bedre at oprette en større region end mange små regioner.
   3. Overhold de blå kryds, der allerede er på dråbebillederne, som er resultatet af en algoritme designet til automatisk at lokalisere krystallinske objekter (CHiMP). For at visualisere CHiMP-vurderingen af krystalliseringsdråber skal du klikke på afkrydsningsfeltet Vis Auto Scores og derefter ændre rullemenuen for Klasse. Typisk er den mest nyttige indstilling her krystalindstillingen (figur 4B).
      BEMÆRK: Dette er en ny funktion, og det er ikke garanteret at finde alle krystaller og kan også finde andre objekter, der ikke er krystaller.
   4. Når alle punkter og regioner er markeret i de respektive dråber, skal du klikke på knappen Forbered dataindsamling nederst på siden.
4. Forberedelse af prøver til dataindsamling
   1. Overhold listen over prøver, der indeholder de punkter eller regioner, der blev valgt i det foregående trin eller automatisk placeret (figur 4C). Tilføj individuelle punkter eller områder ved at trykke på knappen + , eller tilføj alle viste eksempler ved at klikke på knappen Føj aktuel side til kø .
   2. Filtre er kun tilgængelige for at vise punkt, region, autopunkter eller manuelle punkter. Hvis du kun vil have vist de prøver, der ikke er optaget (dvs. udsat for røntgenstråler), skal du klikke på indstillingerne Uden data og Ikke fuldført over filterknapperne.
   3. Vælg individuelle prøver ved at klikke på den respektive linje, og opdater billedet i højre side af skærmen for at vise det korrekte fald og individuelle punkt. Hvis der er mange eksempler på listen, kan du øge antallet af eksempler , der vises pr. side, ved at vælge rullemenuen med 10 som standard og op til 100 som det maksimale antal viste eksempler.
   4. Når alle punkter og områder er føjet til køen, skal du sikre dig, at alle parametre for eksperimentel dataindsamling er knyttet til hvert eksperiment.
      1. Brug filtre til Punkt, Region, Manuel og Auto. Klik på punktfilteret , og klik på afkrydsningsfeltet Vælg alt under filterknapperne for samtidig at anvende parametre på alle prøver, der er synlige på den aktuelle liste over eksempler i kø .
      2. Vælg eksperimentelle parametre i rullemenuen i højre side af skærmen under drop-billedet (figur 4D). For områder skal du vælge indstillingen Grid Scan DMM 10 mikron trin, 100 procent transmission. For alle andre punkteksperimenter skal du vælge andre indstillinger i rullemenuen efter behov.
      3. For oscillationsdataindsamlinger skal du klikke på Omega Scan DMM 60 grader 5 procent transmission mulighed for at indsamle den maksimale mængde data fra en individuel prøve. Anvend små rotationer til meget små krystaller eller strålingsfølsomme prøver og varier transmissionen baseret på tidligere erfaringer med en bestemt krystalform. Når alle eksempler har eksperimentelle parametre anvendt korrekt, skal du klikke på knappen Købeholder nederst på siden.
   5. Når pladen har nået toppen af køen, præsenteres den for strålelinjen, datasæt indsamles, og derefter vender den tilbage til prøvelageret inden for strålelinjen. Når dataindsamlingen fra en plade er afsluttet, skal du kigge efter en e-mail med et link, du skal følge for at få adgang til de relevante data.
5. Oprette eksempelgrupper
   BEMÆRK: Prøvegrupper kan oprettes for at gruppere lignende prøver på tværs af flere dråber eller plader. Alle datasæt inden for disse eksempelgrupper behandles ved hjælp af pipelinen xia2.multiplex¹⁴ , når de er behandlet af DIALS. Dette kan være nyttigt, når man indsamler mange meget små kiler af data og kan også være nyttigt til at øge signal-til-støj til ligandbindende eksperimenter.
   1. Vælg Administration af eksempelgruppe i rullemenuen under forslagsnummeret. Se efter en liste over grupper, hvis de allerede er oprettet af andre brugere. Hvis du vil generere en ny gruppe, skal du klikke på knappen +Opret eksempelgruppe . Klik på en forsendelse i rullemenuen på siden Opret eksempelgruppe for at se eksempelfremviseren (figur 5A). Klik på beholderen med de relevante eksempler på den liste, der er udfyldt.
   2. Når der er klikket på en container, skal du kigge efter en grafik, der viser pladeoversigten.
   3. Klik på dråber individuelt ved at klikke på den enkelte dråbe (figur 5B) eller klik på dråber i rækker eller kolonner ved at klikke på det relevante rækkebogstav eller kolonnenummer. Når alle felter, der er knyttet til en individuel gruppe, er markeret, skal du angive et navn til gruppen i boksen Eksempelgruppenavn og klikke på knappen Gem eksempelgruppe . Klik på knappen Vis eksempelgrupper på denne side for at vende tilbage til listen over allerede genererede eksempelgrupper, der er knyttet til forslaget (figur 5C).
6. Redigering af eksempelgrupper
   1. Klik på en eksempelgruppe på listen over grupper på siden Administration af eksempelgrupper .
   2. Klik på knappen +Rediger eksempelgruppe ved siden af de containere, der vises under gruppeoplysningerne (figur 5C).
   3. Overhold dråberne, der allerede er knyttet til en prøvegruppe, fremhævet på pladeoversigten.
   4. Føj flere dråber til eksempelgruppen ved at klikke på slip, felter eller kolonner som før.
      BEMÆRK: Dråber kan ikke fjernes fra en prøvegruppe.
   5. Når der er tilføjet yderligere dråber, skal du redigere eksempelgruppenavnet og derefter gemme det eller bare gemme det ved at klikke på knappen Gem prøvegruppe .
7. Visualisering og analyse af output fra prøvegrupper
   1. Klik på en individuel gruppe på listen over eksempelgrupper for at få vist pladeoversigten over den eller de containere, der er knyttet til gruppen. De dråber, der er inkluderet i gruppen, fremhæves på dette display (figur 5D).
   2. Se efter en liste, der indeholder de kronologiske sidste tre multiplexjob, hvis der er indsamlet data i denne gruppe.
   3. Klik på linjen for en multiplexkørsel for at opdatere behandlingsresultaterne nedenfor.
   4. Hold øje med knappen til hurtig link , som viser antallet af datasæt, der er knyttet til gruppen. Klik på denne knap for at åbne en ny side med dataindsamlinger , der viser de enkelte datasætsamlinger.

3. Adgang til automatisk databehandling

BEMÆRK: Når dataene er indsamlet, sendes de gennem flere automatiske databehandlingsrørledninger. De fire standardrørledninger, der anvendes på tværs af MX-strålelinjerne hos Diamond, køres også på data indsamlet ved strålelinjen. De er 'fast_dp', 'xia2-skiver', 'xia2 3dii' og 'autoPROC'15. 'fast_dp' vil give en hurtig datareduktion for hurtigt at vurdere kvaliteten. De tre andre pipelines vil kræve mere beregningstid og køre en række forskellige softwarepakker til datareduktion til sammenligning. Derfor er outputtet normalt af højere kvalitet end 'fast_dp' output. Datasæt, der indsamles på strålelinjen, vil også køre gennem den automatiske multikrystalfletningssoftware 'xia2.multiplex'14, som fletter alle datasæt inden for en defineret gruppe. Bemærk, at selvom gitterscanninger i øjeblikket ikke behandles automatisk, kan dataene behandles manuelt ved hjælp af pipelinen 'xia2.ssx'. Resultaterne af de automatiske behandlingsrørledninger findes i ISPyB¹¹ ved hjælp af følgende protokol.

1. Lokalisering af datasæt
   1. Log ind på ISPyB som beskrevet ovenfor, og vælg Forslag.
   2. Søg efter forslaget af interesse ved at rulle eller skrive forslagsnummeret i søgefeltet.
   3. Klik på det ønskede besøg på listen, der vises på skærmen, for at få adgang til vinduet Dataindsamlinger for det pågældende besøg.
   4. Anvend de ønskede filtre.
      BEMÆRK: Et populært filter er filteret "Automatisk integreret", som kun viser datasæt, der er kørt korrekt gennem en eller flere behandlingspipelines. Dette udelukker gitterscanninger, da disse i øjeblikket ikke behandles automatisk via ISPyB.
   5. Rul ned på siden for at finde det datasæt, du er interesseret i.
      BEMÆRK: Hvert datasæt viser eksempel-id'et, de anvendte eksperimentelle parametre, en diffraktionsbilledfremviser, en krystalbilledfremviser og et analyseplot pr. billede til hurtig observation af datakvaliteten.
2. Sådan får du adgang til resultaterne af automatisk behandling
   1. Klik på fanen Automatisk behandling under dataoversigten for et bestemt eksperiment for at undersøge resultaterne af den automatiske datareduktion (figur 6A).
   2. Klik på de forskellige faner, der svarer til de forskellige rørledninger for at se en detaljeret oversigt over hvert output.
      BEMÆRK: Hvis der er defineret eksempelgrupper, vil der være to faner, der svarer til multiplexjob. Det ene svarer til fletningen af alle datasæt i gruppen indtil dette tidspunkt, mens det andet kun svarer til fletningen af datasæt inden for denne dråbe.
   3. Klik på knappen Logfiler og filer for at downloade de resulterende .mtz-filer, hvis behandlingen var vellykket, og eventuelle tilknyttede logfiler. Klik på fanen Downstream-behandling under afsnittet Automatisk behandling for at se output fra DIMPLE.
      BEMÆRK: DIMPLE kører kun, hvis der blev leveret en PDB-fil under indsendelse af eksempler.
   4. Klik på Logfiler &; Filer knappen for at downloade ethvert resulterende output fra DIMPLE.
3. For at få adgang til gruppemultiplexresultaterne skal du åbne rullemenuen øverst på skærmen med forslagsnummeret skrevet på det og klikke på Eksempelgruppeadministration. Klik på rækken , der svarer til den ønskede gruppe i den korrekte container. Rul ned for at finde listen over multiplexudgange , der svarer til gruppen, som repræsenteret visuelt af et diagram over pladen.
   1. Klik på den ønskede multiplexudgang fra den givne liste. Klik på knappen xxx datasæt , hvor xxx er antallet af flettede datasæt (figur 6B).
      BEMÆRK: Dette åbner skærmbilledet Dataindsamlinger , men kun datasættene fra det valgte multiplexjob vises.
   2. Klik på fanen Automatisk behandling i det øverste eksperiment.
   3. Klik på fanen Multiplexbehandling , der svarer til det korrekte antal flettede datasæt.
   4. Klik på knappen Logfiler og filer for at downloade .mtz og tilsvarende logfiler (som i trin 3.2.3.)
4. Sådan får du adgang til resultaterne af gitterscanningen
   1. Naviger til skærmbilledet Dataindsamlinger for det ønskede besøg. Resultaterne af gitterscanningsdataene vises sammen med eventuelle indsamlede rotationsdata.
      BEMÆRK: Der vil ikke være nogen resultater for automatisk behandling.
   2. Billedet af krystaldråben vil have gitteret overlejret med et varmekort, der repræsenterer tilstedeværelsen af diffraktion. Klik på en firkant for at se diffraktionsbilledet for den pågældende position i gitteret. Klik på rullemenuen øverst i krystalbrøndbilledet for at ændre, hvad varmekortet repræsenterer. Standarden er total intensitet af diffraktion, men kan ændres til samlede pletter, estimeret opløsning eller rammer uden is.

4. Databehandling

BEMÆRK: Udvalgte datasæt kan behandles igen via ISPyB^{11-grænsefladen} ved hjælp af de samme behandlingspipelines, der køres automatisk med ændrede indstillinger som defineret af brugeren. En opløsningsafbrydelse kan anvendes; Hvis krystallens symmetri/celle er kendt, kan dette også defineres for at sikre, at behandlingsrørledningerne kører i den korrekte indstilling. Udvalgte billedområder på tværs af specifikke datasæt kan også flettes ved hjælp af tilgængelige pipelines med flere krystaller. Dette kan vise sig fordelagtigt, hvis systematiske strålingsskader får den sidste del af diffraktionsbillederne til at være af dårlig kvalitet. Det er også en mulighed for brugeren at downloade deres datasæt ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor og køre deres ønskede oparbejdningssoftware lokalt, hvor tutorials er frit tilgængelige andetsteds (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Sådan genbehandles flere individuelle datasæt
   1. Log ind på ISPyB, og naviger til de relevante datasæt (trin 3.1).
   2. Klik på et datasæt , og klik på tandhjulsikonet i datasættets titellinje (figur 6) for at åbne oparbejdningsvinduet.
   3. Konfigurer de ønskede indstillinger, og vælg hvilke rammer der skal medtages i oparbejdningen.
      BEMÆRK: Billedområdet kan defineres enten ved at skrive et område i de mærkede bokse eller ved at klikke og trække det ønskede område i analyseplottet pr. billede (figur 7A).
   4. VALGFRIT: Hvis du vil tilføje et andet datasæt til individuel oparbejdning, skal du klikke på dets tandhjulsikon , hvorefter det vises i oparbejdningsvinduet under det første datasæt. Markér afkrydsningsfeltet Behandl individuelt .
   5. Klik på knappen Integrer .
2. Sådan oparbejdes multikrystaldata
   1. Åbn oparbejdningsvinduet fra ethvert datasæt.
   2. Klik på knappen Multi-Crystal for at åbne en ny skærm.
   3. Rul ned for at finde en række per-image analyse plots fra eksperimenter under besøget.
   4. Vælg en behandlingspipeline i rullemenuen.
   5. VALGFRIT: Definer eventuelle opløsningsgrænser eller kendte enhedscelleparametre.
   6. Klik og træk for at definere billedområder, der skal medtages i multikrystaloparbejdningen (figur 7).
      BEMÆRK: Dette skal gøres over flere forskellige plots, så datasæt fra flere forskellige krystaller flettes.
   7. Klik på knappen Integrer (figur 7B).
3. Sådan får du adgang til oparbejdede data
   1. Gå til siden Dataindsamlinger for det specifikke besøg (trin 3.1.1-3.1.3).
   2. Klik på knappen Oparbejdning øverst på skærmen.
   3. Rul ned for at finde det ønskede job.
   4. Klik på filstien i højre kolonne for at åbne skærmbilledet Dataindsamlinger for de oparbejdede data.
   5. Åbn fanen Automatisk behandling , og download data som beskrevet tidligere (trin 3.2).
      BEMÆRK: Alle oparbejdede job kan identificeres ved hjælp af symbolet med cirkulære pile ud for rørledningsnavnet.

Representative Results

Krystalliseringsanlægget og VMXi-strålelinjen er blevet brugt til en lang række projekttyper og brugssager. Her er et lille antal eksempler for at illustrere, hvad brugerne måske ønsker at forfølge.

Casestudie 1: Standard dataindsamling

Strålelinjen muliggør hurtig bestemmelse af stuetemperaturkrystalstrukturer fra et lille antal krystaller i en krystallisationsplade. Det mindste antal krystaller afhænger af rumgruppen og krystalorienteringen, men er ofte 1-4, selvom forbedret datakvalitet kan opnås ved at fusionere data fra flere titalls krystaller. Et nyligt eksempel er en af beamline-standarderne, thaumatin. Flere krystaller, vist i figur 8A, blev markeret til dataindsamling manuelt som beskrevet i protokolafsnit 2.3. Disse krystaller blev føjet til køen som beskrevet i protokolafsnit 2.4, og eksperimentelle parametre blev valgt fra rullelisten. Når eksperimentelle parametre var blevet anvendt, blev pladen sat i kø til dataindsamling. Datasæt blev indsamlet, automatisk skaleret og flettet ved hjælp af xia2.multiplex-pipelinen som beskrevet i protokolafsnit 3. Et eksempel på output fra SynchWeb er vist i figur 8A i midten. Fem flettede datasæt gav anledning til et datasæt med en opløsning på 1,66 Å. Til standard dataindsamling af ca. fem krystaller i en brønd blev datasæt indsamlet inden for 2,5 min.

Casestudie 2: Ligandbinding – Fragmenteksperiment med Mac1-protein

Fremstilling af strukturer af protein-ligandkomplekser ved stuetemperatur kan ligetil opnås ved hjælp af strålelinjen. Ligander kan tilsættes til dråber på krystallisationsplader (enten manuelt eller ved akustisk dråbeinjektion) og data måles efter en passende inkubationstid. I eksemplet beskrevet her blev en række fragmenter dispenseret i brønde indeholdende krystaller af SARS-CoV-2 første makrodomæne af proteinet nsp3 (Mac-1) i en krystallisationsplade. To af brøndene indeholdende det samme fragment blev tildelt som en gruppe som beskrevet i protokoltrin 2.5. Flere krystaller (42) blev markeret til dataindsamling som beskrevet i protokoltrin 2.3 og 2.4, og datasæt blev indsamlet ved hjælp af standardparametre (60° rotation, 0,1° trin, 0,00178 s eksponering, 5% transmission, 16 KeV - pr. krystal) (figur 8B). Datasæt fra de to brønde blev automatisk behandlet ved hjælp af pipelinen xia2.dials, og derefter blev pipelinen xia2.multiplex startet for automatisk at flette 22 af disse datasæt. DIMPLE blev derefter kørt på outputtet af disse rørledninger og gav kort, der tydeligt viste tegn på det bundne fragment. Fragmentmodellen blev indbygget i den ledige tæthed og yderligere raffineret (figur 8B til højre). Ligandbundne strukturer ved stuetemperatur kan let bestemmes ved hjælp af denne række trin for at give uvurderlig information og feedback til den strukturbaserede lægemiddeldesignproces. Til denne dataindsamling af 42 krystaller på tværs af en række brønde blev datasæt indsamlet inden for 10 minutter.

Casestudie 3: Strukturløsning med rumgruppe med lav symmetri og foretrukne retninger En stak af flere krystaller med pladelignende morfologi blev fremstillet fra krystalliseringseksperimenter med en c-type gasbindende cytokrom (figur 8C). Ved at vælge flere positioner rundt om kanten af stakken, hvor kun en enkelt krystal var i røntgenstrålen, var det muligt at opnå et datasæt af god kvalitet til 1,75 Å opløsning ved at fusionere kiler fra fire krystaller på trods af en monoklinisk (C2) rumgruppe. Dette muliggjorde hurtig fremdrift af projektet uden behov for yderligere at optimere krystalliseringsbetingelserne. Dette resultat er beskrevet tidligere⁹. Til denne dataindsamling af fire krystaller i en brønd blev datasæt indsamlet inden for 2 minutter.

Casestudie 4: Indhentning af information og rumtemperaturstruktur fra mikrokrystaller i en plade ved hjælp af seriel krystallografi

Ofte når mikrokrystaller vises i en dråbe, eller når brugere søger at optimere mikrokrystalliseringsprotokoller i batch som en forløber for serielle krystallografieksperimenter ved synkrotron- eller XFEL-kilder, er det meget nyttigt at få hurtig feedback om diffraktionsegenskaberne og enhedscelledimensionerne i forskellige forsøg ved hjælp af minimalt materiale. I dette brugstilfælde blev mikrokrystaller af lysozym, der vokser i batch, pipetteret ind i en krystallisationsplade (200 nL volumen pr. Dråbe) og data indsamlet fra otte dråber ved hjælp af en gitterscanning med en trinstørrelse på 10 μm (figur 9). De resulterende 25.906 stillbilleder blev behandlet ved hjælp af seriel krystallografisoftware, hvilket resulterede i et datasæt, hvor 9.891 diffraktionsmønstre blev indekseret og fusioneret, hvilket gav et datasæt til 2,0 Å opløsning, der raffinerede godt mod den offentliggjorte stuetemperaturstruktur (_R-arbejde = 19,6%,_R-fri = 23,6% ved hjælp af PDB 8A9D) (tabel 1). Dette muliggjorde detaljeret analyse af enhedscellefordeling og en bestemmelse af mikrokrystalrumtemperaturstruktur, der kunne indgå i komplekse serielle krystallografieksperimenter, herunder tidsopløste undersøgelser. Det totale krævede volumen mikrokrystalsuspension var 1,6 μL. Til denne dataindsamling af mikrokrystaller på tværs af otte brønde ved hjælp af gitterscanninger blev datasæt indsamlet inden for 40 minutter.

Figur 1: Skematisk oversigt over protein-til-struktur-pipelinen, der integrerer krystalliseringsscreening, optimering på krystalliseringsanlægget, automatiseret dataindsamling og -behandling ved stuetemperatur uden prøvehøst ved VMXi, XChem-fragmentscreening og dataindsamling ved andre MX-strålelinjer. Brugere kan starte rørledningen ved at levere en prøve eller ved at bringe plader til VMXi-strålelinjen. Forkortelse: Alsidig makromolekylær krystallografi in situ. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Mosquito SPT Labtech-grænsefladen til opsætning af krystalliseringsplader. (A) (1) MiTeGen In Situ-1-opsætningsvisningen. Vælg MiTeGen 2 drop standardplade ved at gå til (2) 96-brønds pladetypen og vælge (3) MiTeGen plade 2 dråbeplade. For at ændre definitionsparametrene for drop 1 og drop 2, som kræves til VMXi, skal du klikke på (4) redigeringsikonet . Dette åbner et nyt vindue (B), hvor (5) X- og Y-forskydningerne skal ændres som vist. Vælg (B) underfelt 2 og (C) underfelt 3 , og rediger værdierne i overensstemmelse hermed. (D) CrystalQuickX-opsætningsvisningen . Vælg CrystalQuickX 2 drop standardplade ved at gå til 96-brønds pladetypen og vælge MiTeGen plade 2 dråbeplade. For at ændre definitionsparametrene for drop 1 og drop 2, som kræves til VMXi, skal du klikke på redigeringsikonet det samme som ovenfor. Dette åbner et nyt vindue, hvor (E,F) X- og Y-forskydningerne skal ændres som vist. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: SynchWeb-grænsefladen, der viser, hvordan du opretter en VMXi-forsendelse, registrerer en plade og kontrollerer kontaktoplysninger. Skærmbilleder af de forskellige faser af upload af oplysninger til SynchWeb-grænsefladen vises fra (A) rullemenuen, (B,C) registrering af en ny forsendelse, (D) registrering af en ny container, (E) indtastning af pladeoplysninger, (F) kontrol af kontaktoplysninger og (G) en liste over registrerede containere i et forslag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Valg og forberedelse af prøver til dataindsamling ved hjælp af SynchWeb. Der vises en række skærmbilleder, der viser de forskellige stadier i forberedelsen af prøver til dataindsamling ved hjælp af SynchWeb-grænsefladen. (A) Punkter og interesseområder vælges fra dropoversigten. I den nederste del af dette panel er der en kronologisk serie af fotografier af en dråbe. (B) Et eksempel på CHiMP-output for en plade, der fremhæver resultater for kategorien 'krystal'. (C) Tilføjelse af prøver til køen fra listen over udvalgte punkter og regioner og (D) anvendelse af parametre til dataindsamling på de prøver, der er sat i kø fra rullelisten over strålelinjeoprettede eksperimentindstillinger. Bemærk forskellen mellem prøver uden eksperimentelle parametre (i rødt) versus dem, der har korrekt anvendte parametre (top og bund). Nederst i dette panel er knappen Købeholder , som sætter pladen i kø, der skal opsamles på strålelinjen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Oprettelse af eksempelgruppe i SynchWeb. En række skærmbilleder, der viser de forskellige stadier i oprettelsen af eksempelgrupper. (A) Pladen/pladerne med prøver udvælges fra den relevante forsendelse, og (B) dråberne i pladen udvælges. Disse kan være individuelle dråber eller kan vælges efter række og/eller kolonne. (C) En liste over stikprøvegrupper, der allerede er oprettet. (D) Outputtene fra de sidste tre multiplexbehandlingsjob er angivet og kan vælges til at vise statistikker fra forarbejdningspipelinen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Databehandling og datareduktion. (A) Skærmbillede af et behandlet datasæt i ISPyB¹¹. Knappen til at få adgang til oparbejdningsfunktioner er fremhævet. Eksempel-id og eksperimentelle parametre vises øverst til venstre og diffraktionsbilledfremviseren i midten. Ved at klikke på dette billede åbnes et interaktivt vindue for at undersøge forskellige billeder. Krystalbilledfremviseren vises til højre, og ved at klikke på dette billede åbnes også et interaktivt vindue for at sammenligne beamline- og Formulatrix-lagringsbilleder. Per-billedanalyseplot vises yderst til højre, og ved at klikke på dette billede åbnes en forstørret version af dette output. Ved at klikke på fanen Automatisk behandling bliver autobehandlingen synlig og gør det nemt at sammenligne resultaterne af de forskellige rørledninger. Klik på fanerne for at skifte mellem de forskellige behandlingspipelines og se det detaljerede output fra den valgte pipeline. Knappen Logfiler og filer til download af data er fremhævet. Hvis du klikker på fanen Downstream-behandling , udvides og giver resultater for alle datasæt, der køres gennem pipelines efter datareduktion, hvor det er relevant. (B) Skærmbillede fra skærmbilledet Eksempelgruppestyring . Det brugerdefinerede gruppenavn er øverst, og den visuelle beskrivelse af de inkluderede brønde kan ses nedenfor. En grøn brønd angiver, at alle krystaller målt fra denne dråbe vil blive inkluderet i gruppen. En oversigt over forskellige multiplexjob udført på denne gruppe kan ses, og nedenunder er det detaljerede output fra multiplex. Knappen Datasæt til undersøgelse af de inkluderede eksperimenter er fremhævet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Vinduer for databehandling. (A) Individuelle og (B) multikrystaldatasæt. Der vises to individuelle datasæt, hvor der er valgt dataområder. Når afkrydsningsfeltet Behandl individuelt er markeret, behandles de valgte diffraktionsbilleder individuelt ved at trykke på knappen Integrer . Hvis du klikker på knappen Multikrystal , åbnes en visning af de enkelte datasæt. Hvis du vil genbehandle diffraktionsbilleder fra flere datasæt, vælges områder af billeder som vist, og genbehandlingen startes ved at klikke på knappen Integrer som fremhævet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Repræsentative resultater fra VMXi-pipelinen. (A) Markerede krystaller for protein thaumatin inden for et krystalliseringsfald (venstre panel), databehandlingsresultater (midterpanel) og elektrondensitet (højre panel). (B) Indsamling på flere krystaller for at bestemme binding af fragmentet til SARS-CoV-2 makrodomæne. Datasæt blev indsamlet på flere krystaller i nærværelse af et fragment fra EU-OPENSCREEN-fragmentskærmen ved hjælp af standardforsøgsindstillinger. Eksempler på disse dataindsamlinger er vist i dette uddrag fra SynchWeb. Fragmentet blev indbygget i den tilsvarende tæthed og yderligere raffineret, som det vises længst til højre. (C) Markerede monokliniske krystaller i en stak fra et udfordrende krystallisationshit, der anvendes til dataindsamling. Grønne kryds og røde tal angiver, hvor data blev målt ved hjælp af en 10 μm stråle og 60 ° rotation. Fire af de resulterende kiler blev slået sammen for at producere et datasæt med en opløsning på 1,75 Å. Elektrontæthed omkring Heme-gruppen vises til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Seriel krystallografi i krystallisationspladen. (A) Optisk billede af krystallisationsdråben med en hvid boks, der repræsenterer det pågældende område. B) Definition af netscanningspunkter. (C) Varmekort, der angiver diffraktion. (D) Elektrontæthedskort fra et serielt krystallografidatasæt fra mere end 9.000 stilldiffraktionsmønstre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Opløsning (Å)	Fuldstændighed (%)	Mangfoldighed	I/σ(I)	Ropdelt	CC1/2	Unikke observationer
Samlede	100	95.5	20.8	0.063	0.998	8422
Lav (55,55 - 5,43)	100	147.1	81.7	0.028	0.999	488
Høj (2,03 -2,00)	100	75.3	1.2	1.092	0.410	411

Tabel 1: Datastatistik for VMXi RT serielt datasæt. Forkortelser: I = gennemsnitlig intensitet af de skalerede observationer; _R-split = et mål for afvigelse mellem de målte intensiteter CC 1/2 = korrelationskoefficient mellem to tilfældige halvdele af datasættet.

Discussion

Vi har beskrevet den fulde procedure fra ankomsten af en proteinprøve til brugerens download af de endelige data til yderligere applikationer. Kritiske trin er produktion af en proteinprøve af høj kvalitet og passende krystalskærme, enten ved hjælp af kommercielle sparsomme matrixskærme eller optimeringsskærme baseret på etablerede forhold. Denne proces kan finde sted i CF, eller brugerne kan udføre krystallisationsprocedurerne i hjemmelaboratorierne og bringe passende krystallisationsplader til strålelinjen. Det kan være vigtigt at identificere egnede dataindsamlingsparametre for visse prøver, navnlig når strålingsskader giver anledning til bekymring. I de fleste tilfælde er automatiseret databehandling fuldt ud tilstrækkelig til at besvare det videnskabelige spørgsmål, selvom brugerne bevarer evnen til at oparbejde ved hjælp af strålelinjeværktøjerne, for eksempel hvor rumgruppen er tvetydig, eller kun den indledende del af de indsamlede data bruges til at minimere strålingsskadevirkninger.

Hvis egnede krystaller ikke produceres fra indledende krystalliseringsforsøg, kan ændringer i proteinkoncentration, renhed eller krystalliseringsskærme undersøges, ligesom brugen af krystalsåning. Hvis krystaller ikke diffrakterer til en nyttig opløsning ved strålelinjen, kan gitterscanninger anvendes med en unatueret stråle til at vurdere krystallernes iboende diffraktionsgrænse og enhedscelle for at styre optimeringsindsatsen. Krystaller, der er for små til dataindsamling i plader (f.eks. <10 μm), kan i stedet være egnede til seriel krystallografi eller nanofokuseksperimenter (f.eks. ved Diamond beamline VMXm). Løsning af strukturer ved hjælp af VMXi-data er generelt ligetil ved molekylær udskiftning, især siden fremkomsten af Alphafold¹⁶ for at give effektive søgemodeller. Hvis dette ikke lykkes, kan krystaller høstes og kryokøles fra plader for at muliggøre konventionelle enkeltbølgelængde anomal diffraktion, multibølgelængde anomal diffraktion eller lange bølgelængde faseeksperimenter.

Fordelene ved denne metode omfatter evnen til at opnå hurtige datasæt af høj kvalitet og feedback direkte fra krystalliseringsplader uden behov for at forstyrre krystaller fra de miljøer, hvor de er vokset. Den såkaldte 'stuetemperaturrenæssance' inden for strukturel biologi lægger vægt på strukturer opnået under ikke-kryogene forhold for at muliggøre mere fysiologisk relevans og proteindynamik, der skal udforskes². Normalt opnås en lidt lavere opløsning end for en optimeret kryokølet krystal, men kun når der er etableret passende kryoforhold, og hvis krystallerne er robuste over for mekanisk håndtering og åbning af krystallisationsdråbe³. En kommende applikation, som denne pipeline er meget velegnet til, er en storstilet screening af protein-ligandkomplekser eller fragmentkampagner ved stuetemperatur i lægemiddelopdagelse. Ligander eller fragmenter kan enten cokrystalliseres eller tilsættes ved pipette eller akustisk dråbeudslyngning før dataindsamling ved stuetemperatur. En anden applikation er hurtigt at måle data fra mange hundrede eller tusinder af krystaller på en yderst effektiv måde og derefter bruge DIALS¹⁷ multiplex^14-softwaren til at ekstrahere isomorfe klynger, der kan repræsentere forskellige biologiske enheder eller til at etablere statistisk signifikante forskelle mellem populationer af krystaller, der er blevet behandlet på en anden måde eller udsat for forskellige ligander eller signaler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion