Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Engineering Tendon Assembloids å sonde Cellular Crosstalk i sykdom og reparasjon

Published: March 22, 2024 doi: 10.3791/65987
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Orthopedics, Balgrist, University Hospital Zurich, University of Zurich, 2Department of Health Sciences and Technology, Institute for Biomechanics, ETH Zurich

Summary

Her presenterer vi et assembloidmodellsystem for å etterligne senecellulær crosstalk mellom det bærende senekjernevevet og et ekstrinsisk rom som inneholder cellepopulasjoner aktivert av sykdom og skade. Som et viktig brukstilfelle demonstrerer vi hvordan systemet kan distribueres for å undersøke sykdomsrelevant aktivering av ytre endotelceller.

Abstract

Sener muliggjør bevegelse ved å overføre muskelkrefter til bein. De er avhengige av en tøff senekjerne som består av kollagenfibre og stromale cellepopulasjoner. Denne bærende kjernen er omfattet, næret og reparert av et synoviallignende vevslag som består av det ytre senekammeret. Til tross for denne sofistikerte designen er seneskader vanlige, og klinisk behandling er fortsatt avhengig av fysioterapi og kirurgi. Begrensningene i tilgjengelige eksperimentelle modellsystemer har bremset utviklingen av nye sykdomsmodifiserende behandlinger og tilbakefallsforebyggende kliniske regimer.

In vivo studier på mennesker er begrenset til å sammenligne friske sener med sykdomst eller sprukket vev i sluttstadiet som ble tatt prøver under reparasjonskirurgi, og tillater ikke longitudinell studie av den underliggende senesykdommen. In vivo dyremodeller presenterer også viktige grenser med hensyn til ugjennomsiktig fysiologisk kompleksitet, den etiske byrden for dyrene og store økonomiske kostnader forbundet med bruken av dem. Videre er in vivo dyremodeller dårlig egnet til systematisk undersøkelse av legemidler og flercellede interaksjonsveier for flere vev. Enklere in vitro-modellsystemer har også kommet til kort. En viktig årsak er en manglende evne til å tilstrekkelig replikere den tredimensjonale mekaniske belastningen som er nødvendig for å meningsfylt studere seneceller og deres funksjon.

Det nye 3D-modellsystemet som presenteres her, lindrer noen av disse problemene ved å utnytte murine tail tendon core explants. Det er viktig at disse eksplantene er lett tilgjengelige i stort antall fra en enkelt mus, beholder 3D in situ-lastemønstre på mobilnivå, og har en in vivo-lignende ekstracellulær matrise. I denne protokollen gis trinnvise instruksjoner om hvordan man forsterker senekjerneplanter med kollagenhydrogeler lastet med muskelavledede endotelceller, seneavledede fibroblaster og benmargsavledede makrofager for å erstatte sykdoms- og skadeaktiverte cellepopulasjoner i det ytre senekammeret. Det er demonstrert hvordan de resulterende seneassembloidene kan utfordres mekanisk eller gjennom definerte mikromiljøstimuli for å undersøke nye flercellede crosstalk under sykdom og skade.

Introduction

I sin funksjon av å overføre muskelkrefter til beinene for å muliggjøre bevegelse, står sener overfor noen av de mest ekstreme mekaniske påkjenningene som forekommer i menneskekroppen 1,2,3. På grunn av aldrende samfunn, økende fedmeutbredelse og den økende populariteten til mekanisk krevende sportsaktiviteter, forventes forekomsten av senesykdommer og skader å klatre i utviklede land 4,5,6. Utviklingen av nye evidensbaserte og sykdomsmodifiserende behandlingsregimer for å bekjempe denne økningen har blitt hindret av begrensninger i dagens tilgjengelige modellsystemer 1,7,8.

Ideelt sett ville sykdoms- og skadereparasjonsmodeller tillate å studere hvordan målorganet behandler et definert sett med inngangsparametere (imiterende sykdomsutløsere, tabell 1) til målbare utgangsparametere (som representerer sykdomskjennetegn, tabell 2) mens man kontrollerer for konfunderende faktorer. Studier ved hjelp av slike modellsystemer vil da kunne identifisere de (pato-) fysiologiske prosessene som ligger til grunn for reparasjon av sykdom og skade og få kunnskap som kan utnyttes til å forebygge eller redusere sykdoms- og skadekjennetegn i klinikkene. Ved å anvende dette prinsippet på sener, bør et nyttig modellsystem rekapitulere sentrale deler av in vivo seneresponsen på sykdom og skade, som omfatter følgende kjennetegn: mikroskader, betennelse, neovaskularisering, hypercellularitet, akselerert matriksomsetning og dekompartmentalisering 9,10,11,12,13,14,15 . Ved å bruke disse kjennetegnene som base, kan følgende krav til et vellykket senesykdom og skadereparasjonsmodellsystem utledes.

Mekanisk overbelastning antas å være en sentral faktor ved seneskade og sykdomspatogenese og er dermed en mye brukt eksperimentell tilnærming for å skape mikroskader16. Kontrollerbar mekanisk lastbarhet er derfor en viktig forutsetning for senesykdom og skadereparasjonsmodeller. Ideelt sett muliggjør modellsystemet tre hovedmoduser: enkel belastning fra strekk til skade, utmattingsbelastning og lossing 8,17,18. Ved mekanisk deformasjon opplever vev-residente celler en kompleks kombinasjon av spenningskrefter, skjærkrefter (på grunn av glidning av kollagenfibre som omgir cellene) og kompresjonskrefter som oppstår under lossing eller nær enthesis19,20. Modellsystemer bør gjenskape disse komplekse lastemønstrene så nært som mulig.

En alternativ måte å introdusere matriksmikroskade på er å utnytte biokjemiske stressorer som etterligner systemiske predisposisjoner for senesykdom og skade, for eksempel (pro-) inflammatoriske cytokiner, oksidativt stress eller høye glukosekonsentrasjoner 21,22,23. Følgelig er et kontrollerbart nisjemikromiljø fordelaktig for et senesykdom og skadereparasjonsmodellsystem.

En vanlig forutsetning for at modellsystemer skal kunne rekapitulere betennelse, neovaskularisering og hypercellularitet er den selektive tilstedeværelsen av cellepopulasjoner som driver disse prosessene24. For inflammatoriske prosesser inkluderer disse populasjonene nøytrofiler, T-celler og makrofager, mens endotelceller og pericytter ville være nødvendig for å studere neovaskularisering 25,26,27,28,29. Senefibroblaster er ikke bare avgjørende for senereparasjon, men som proliferative og migrerende celler, også delvis ansvarlig for den lokale hypercellulariteten observert i senesykdom 30,31,32,33,34,35,36.

I tillegg til endringer i residente cellepopulasjoner, endres senematrisesammensetningen ved senesykdom og skade samt 7,37,38,39,40. For å presentere de riktige sykdomsrelevante mikromiljøsignalene, bør modellsystemer kunne integrere en ekstracellulær matrikssammensetning tilpasset det målrettede sykdoms- eller skadestadiet, for eksempel ved å muliggjøre relevante proporsjonale kombinasjoner av kollagen-1, kollagen-3 og cellulært fibronektin41.

Oppdelingen av friske sener i senekjernen og de ytre rommene (dvs. endotenon, epitenon og paratenon) er sentral for deres funksjon og ofte forstyrret i syke eller skadede sener 1,42,43,44,45,46,47 . Inkorporering av 3D-seneoppdeling i senemodellsystemer er derfor ikke bare nødvendig for å simulere prosessene som ligger til grunn for de- og re-compartmentalization nærmere, men bidrar også til å etablere de riktige spatiotemporale gradientene av cytokiner og næringsstoffer48,49.

Endelig er modularitet en annen sentral ressurs for modellsystemer, slik at forskere kan kombinere det riktige relative bidraget til og samspillet mellom de tidligere beskrevne stressorene under de undersøkte prosessene 8,17.

I tillegg til å velge de optimale inngangsmodalitetene, er et viktig trinn å kunne måle, observere og spore endringer i den resulterende utgangen. De mekaniske egenskapene til modellsystemet (dvs. tåområdelengde, lineær elastisk modul, maksimal strekkbelastning, maksimal strekkbelastning, utmattingsstyrke og stressavslapping) er sentrale her, da de karakteriserer senens hovedfunksjon 50,51,52. For å knytte disse funksjonelle endringene til endringer på vevsnivå, er det viktig å muliggjøre metoder for å oppdage (kollagen) strukturelle matriksskader og spore spredning og rekruttering av sykdoms- og reparasjonsrelevante cellepopulasjoner 30,53,54,55,56,57,58,59,60.

For å studere nye cellecelle- og cellematrisekrysstal, bør man være i stand til å isolere eller merke proteiner i tilstrekkelige mengder for kvantifisering (dvs. ELISA, proteomikk, immunhistokjemi, flowcytometri)14,21,61,62. Populasjons- eller i det minste romspesifikk genuttrykksanalyse bør også være mulig (dvs. fluorescensaktivert cellesortering [FACS], enkeltcelle / bulk RNA-sekvensering og sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR))21,24,27,63. Modellsystemet skal tillate måling av så mange av de nevnte utgangsparametrene på samme prøve og på flere eksemplarer på en måte som er rask nok til å låse opp studier med høy gjennomstrømning.

Blant modellsystemer som for tiden er tilgjengelige for å studere menneskelig senesykdom og skadereparasjon, er menneskekroppen selv selvfølgelig den mest representative. Det er også minst kompatibelt med eksperimentell intervensjon. Mens pasienter med akutte seneskader er rikelig tilgjengelige for kliniske studier, er pasienter med tidlig tendinopati (den vanligste senesykdommen) stort sett symptomfrie og går ofte klinisk uoppdaget til mer alvorlige endringer manifesterer 14,64,65. Dette gjør det vanskelig å fastslå det kritiske øyeblikket når senehomeostasen sporer av og mekanismene bak denne avsporingen 16,66,67,68,69. I tillegg er uttak av biopsier fra friske sener etisk utfordrende, da det kan føre til vedvarende skade. Hamstring senerester fra fremre korsbånd rekonstruksjon kirurgi brukes ofte som friske kontroller, men uten tvil forskjellig i funksjon, mekaniske egenskaper, cellepopulasjoner og matrikssammensetning sammenlignet med rotator mansjett, akilles, og patellar sener ofte påvirket av senesykdom og skade 70,71,72,73.

In vivo dyremodeller er mer tilgjengelige og håndterbare, men bruken av dem påfører dyrene en betydelig etisk byrde og økonomiske kostnader for forskerne. I tillegg utvikler de fleste av de populære modelldyrene enten ikke tendinopatiske lesjoner spontant (dvs. rotter, mus, kaniner) eller mangler primere og genetisk modifiserte stammer som er nødvendige for å spore de multicellulære kommunikasjonsveiene som er involvert i det (dvs. hester, kaniner).

Enkle 2D in vitro-modellsystemer er på den andre siden av kompleksitets- / trekkbarhetsspekteret og tillater bedre kontrollert, tidseffektiv studie av spesifikke intercellulære kommunikasjonsveier som svar på et mer kontrollerbart sett med utløsere 8,74. Imidlertid klarer disse forenklede systemene ofte ikke å rekapitulere den flerdimensjonale mekaniske belastningen (dvs. spenning, kompresjon og skjær) som er sentral for senefunksjonalitet. I tillegg har de (for) høye stivhetene i vevskulturplast en tendens til å overstyre eventuelle matrikssignaler fra belegg som er ment å etterligne sykdomstilstandenav interesse 75,76.

For å overvinne denne ulempen har stadig mer sofistikerte vevskonstruerte 3D-modellsystemer blitt utviklet for å gi en lastbar matrise hvis sammensetning i det minste delvis kan tilpasses den ønskede sykdomstilstanden 77,78,79. Likevel sliter disse systemene ikke bare med å nøyaktig replikere komplekset in vivo ekstracellulære matrisesammensetninger og cellulære belastningsmønstre, men mangler generelt langsiktig lastbarhet og de kompartmentale grensesnittene som kreves for å studere de tverrkompartmentale kommunikasjonsveiene som koordinerer senesykdom og skadereparasjon 48,49,80.

Ex vivo seneeksplantasjonsmodellsystemer har den klare fordelen av en innebygd in vivo-lignende matrisesammensetning som består av pericellulære nisjer, tverrkompartmentale barrierer, samt spatiotemporal cytokin / næringsgradienter og rekapitulerer komplekse lastemønstre når de strekkes8. Som et resultat av størrelsesavhengige næringsdiffusjonsgrenser er eksplanter fra større dyremodeller (dvs. hester) vanskelige å holde i live for den langsiktige studien av senesykdom og skadereparasjon 81,82,83. I mellomtiden er mindre eksplanter fra murinarter (dvs. akillessenen, patellarsenen) utfordrende å reproduserbart klemme og mekanisk laste. Størrelsen begrenser også mengden materiale som kan samles inn for celle-, protein- og gennivåavlesninger uten å samle prøver og redusere gjennomstrømningen. I denne forstand gir murine halesenefascikler potensialet til å låse opp høy gjennomstrømningsstudie av senesykdom og skadereparasjon, da de er lett tilgjengelige i store mengder fra en enkelt mus, bevare komplekset in vivo pericellulær matrikssammensetning og rekapitulere cellulære belastningsmønstre. Under ekstraksjonsprosessen mister de imidlertid det meste av sitt ytre rom, og det inneholdt vaskulære, immun- og fibroblastpopulasjoner som nå anses å drive senesykdom og reparasjon 8,18.

For å bygge bro over dette gapet er det utviklet et modellsystem som kombinerer fordelene med murine halesene-avledede kjerneplanter med fordelene med 3D hydrogelbaserte modellsystemer. Dette modellsystemet består av en cellebelastet (kollagen-1) hydrogel støpt rundt haleseneexplants 84,85. I dette papiret er de nødvendige produksjonstrinnene gitt i detalj sammen med nyttige avlesninger som kan oppnås ved samdyrking av kjerneplanter (indre rom) i en endotelcellebelastet type-1 kollagenhydrogel (ekstrinsisk rom).

Protocol

Alle metodene beskrevet her ble godkjent av de ansvarlige myndighetene (Canton Zürich-lisensnummer ZH104-18 og ZH058-21). En oversikt er presentert i figur 1.

1. Isolering av sene assembloid komponenter fra 12-15 uker gamle mus (dvs. B6 / J-Rj)

  1. Avlive musene gjennom CO2 gass-indusert kvelning. For å maksimere utbyttet, ikke behandle mer enn 3 mus om gangen og fortsett med celleisoleringen umiddelbart etter eutanasi.
  2. Sikre død ved bilateral induksjon av pneumothorax.
  3. Steriliser musehuden med 80% etanol og flytt musen til en steril biosikkerhetshette.
  4. Isoler halesenekjerneplanter.
    1. Bruk en skalpell (nr. 21) for å skille halen fra musen ved å kutte den ved foten.
    2. Start på tuppen av halen, grip den med pinsetten og vri den for å bryte huden. Trekk deretter pinsetten forsiktig vekk fra halen for å avsløre senekjernens eksplanter.
    3. Plasser senekjerneeksplantene i standardkulturmediet (DMEM / F12 + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin + 1% amfotericin + 1% ikke-essensielle aminosyrer) og skill dem fra den avtrukne haledelen ved hjelp av et nytt skalpellblad (nr. 21).
    4. Gjenta trinn 1.4.2. og 1.4.3. til hele halen er behandlet og seneplantene blir kortere enn 25 mm.
    5. Skjær de isolerte kjerneeksplantene i 25 mm lange stykker ved hjelp av et nytt skalpellblad (nr. 21).
    6. Mål den gjennomsnittlige diameteren til kjerneanleggene med et lysmikroskop koblet til en bildeanalyseprogramvare via et festbart digitalt C-mount-kamera.
      1. Bruk pek og klikk for å velge linjemålingsverktøyet på høyre side.
      2. Mål eksplantens diameter på tre forskjellige steder og beregne deres gjennomsnittlige diameter.
      3. For å lette klemming og mekanisk testing senere, fortsett bare med kjerneplanter som har en gjennomsnittlig diameter større enn 100 μm.
    7. Lossingen kombinert med utstillingen til standard dyrkningsbetingelser (37 °C, 20 %O2, serumtilskudd) endrer genuttrykket innen 6 timer etter isolering og resulterer i nedbrytning innen 7 dager21. For å begynne med en kvasi-homeostatisk tilstand, produser senen assembloids og start forsøkene umiddelbart etter senekjerneisolasjonen.
    8. Avhengig av eksperimentelt oppsett, er devitaliserte senekjerneplanter nødvendig som kontrollgruppe. For å devitalisere senekjerneplanter, frys dem i en liten beholder fylt med flytende nitrogen i 5 s ved hjelp av pinsett og tine dem deretter i 5 s ved romtemperatur (RT). Gjenta denne fryse-tine-syklusen 3 ganger og fortsett med trinn 4 ("Klemme kjerneeksplantene").
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake kuldeforbrenninger, kvelning og sprø mange vanlige materialer. Bruk bare beholdere designet for væsker med lav temperatur, og bruk verneklær (dvs. ansiktsskjerm, passende hansker, lukkede sko).
  5. Isoler senefibroblaster.
    1. Bruk en skalpell (nr. 21) til å lage et tverrgående snitt midt på musens fot. Lag to kutt vinkelrett på foten langs sidene av bakbenene og opp til hoftene fra hver ende av dette snittet.
    2. Bruk pinsetten til å feste den utskårne hudklaffen ved foten og riv av huden som dekker leggmusklene. Når du isolerer endotelceller fra samme mus, fjern hele huden i stedet.
    3. Separer akillessenen fra calcaneusbenet med et nytt skalpellblad (nr. 21). Fikser den løse enden av akillessenen med pinsetten og skill den andre enden fra gastrocnemius-muskelen.
    4. Vask akillessenen en gang i PBS og bruk skalpellen (nr. 21) for å fjerne alt gjenværende muskelvev til bare det hvite senevevet gjenstår. Hvis endotelceller isoleres fra samme mus, la akillessenen være i PBS og fortsett med trinn 1.6. første.
    5. Samle akillessenene fra ett dyr til et 15 ml plastrør inneholdende 10 ml senefordøyelsesmedium (DMEM/F12 + 1% penicillin/streptomycin + 1% amfotericin + 2 mg/ml kollagenase 1) og fordøye i 6-8 timer ved 37 °C under langsom, konstant omrøring ved hjelp av en lavhastighets orbitalshaker ved 15 o / min.
    6. Sentrifuger den fordøyde seneløsningen ved 500 x g i 5 minutter ved RT, aspirer supernatanten og resuspender i 8 ml standardkulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin + 1% amfotericin + 1% ikke-essensielle aminosyrer) og dyrkning i en T25-kulturkolbe under standard kulturbetingelser (37 °C, 20 %O2) i 7 dager uten medieendring. Deretter bytter du media en gang i uken.
    7. Del cellene ved 80% sammenløp i en T150 kulturkolbe (1: 6). Frys cellene ved passasje 2 i 2 ml sterilt filtrert frysemedium (70 % DMEM/F12 + 20 % FBS + 10 % DMSO) fordelt på to 1,5 ml kryorør og hold dem ved -80 °C inntil videre bruk. Bruk trypsin til å fjerne cellene fra vevskulturplasten.
  6. Isoler muskelavledede endotelceller.
    1. Hvis senefibroblaster ikke er isolert fra samme mus, start med trinn 1.5.1 og 1.5.2.
    2. Bruk saks til å skille bakbena fra kroppen ved å kutte i hofteleddet.
    3. Vask bakbenene en gang i kald PBS (~ 4 °C), fjern musklene (quadriceps femoris, extensor digitorum longus, soleus og gastrocnemius) med en skalpell (nr. 21), og legg musklene i en petriskål på is.
    4. Bruk et nytt skalpellblad (nr. 21) til å hakke muskelvevet i biter mindre enn 1 mm3 mens du holder petriskålen på is.
    5. Samle hakket muskelvev fra begge bakbena i et 50 ml plastrør inneholdende 12,5 ml muskelfordøyelsesmedium (PBS + 2 mg/ml kollagenase IV + 2 mg/ml dispase II + 2 mM CaCl2).
    6. Plasser plastrøret i et vannbad på 37 °C i 10 minutter. Rist oppløsningen kraftig og sett den tilbake i ytterligere 10 minutter. Gjenta til oppløsningen ser ut til å være homogen og bare (hvite) biter av sene og fascia er igjen (ca. 4 x 10 min). I mellomtiden fortsetter du med senefibroblastisolasjonen eller makrofagisolasjonen.
    7. Tilsett 12,5 ml kald PBS + 10% FBS til plastrøret for å stoppe fordøyelsen.
    8. Bruk en batteridrevet pipetteholder utstyrt med en 50 ml pipette for å suge suspensjonen fra plastrøret. Utstyr plastrøret med en 400 μm cellesil og filtrer suspensjonen for å fjerne rusk. Gjenta prosessen med en 100 μm cellesil.
    9. Sentrifuger den filtrerte suspensjonen ved 400 x g i 5 minutter ved RT. Resuspender i 10 ml kald PBS + 10% FBS og sentrifuge igjen.
    10. Resuspend i 8 ml endotelkulturmedium (1: 1 blanding av DMEM / F12 og endopan 3-settet + 10 U / ml heparin + 20% FBS + 1% penicillin / streptomycin + 1% amfotericin + 30 mg / ml endotelveksttilskudd) supplert med puromycin (4 mg / ml) for befolkningsvalg.
    11. Frø cellene fra en mus til en T25 kulturkolbe som tidligere ble belagt med 2 ml av en steril 0,2% gelatinløsning i 2 timer ved 37 ° C og deretter tørket over natten ved RT etter fjerning av overflødig løsning. Forbered kolbene dagen før isolasjonen.
    12. Etter 24 timer under standardkulturforhold (37 ° C, 20% O2), fjern puromycintilskuddsmediet, vask de vedlagte cellene en gang med PBS og dyrk dem i 8 ml endotelkulturmedium.
    13. Pass cellene 1: 5 ved 80% sammenløp i gelatinbelagte kolber og bruk dem i eksperimenter til P2. Bruk en annen celleløsning enn trypsin (materialfortegnelse) for å fjerne cellene fra vevskulturplasten og ikke fryse dem.
  7. Isoler benmargsavledede makrofager.
    1. Hvis senefibroblaster eller endotelceller ikke er isolert fra samme mus, utfør trinn 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 og 1.6.3 først.
    2. Etter å ha fjernet huden, senen og muskelvevet, vask de resterende beinene (lårben og tibia) en gang i kald PBS (~ 4 ° C).
    3. Legg beinene i frisk kald PBS (~ 4 ° C) og bruk en skalpell (nr. 21) for gradvis å kutte bort epifysene til benmargen er eksponert. Det vises som en rød prikk på begge sider av beinet.
    4. Utstyr en sprøyte med en 0,4 mm x 25 mm (G27) injeksjonsnål og fyll den med 10 ml makrofagkulturmedium (DMEM/F12 + 10 % FBS + 1 % penicillin/streptomycin + 1 % amfotericin + 1 % ikke-essensielle aminosyrer).
    5. Hold det ene benet etter det andre over et 50 ml plastrør, stikk injeksjonsnålen ca. 1 mm dypt inn i den eksponerte benmargen øverst, og skyll benmargen ut ved å tømme sprøyten. Den spylte benmargen fremstår som en rødlig rørlignende struktur når den suspenderes i mediet.
    6. Løs opp benmargen ved å pipetere den forsiktig opp og ned gjentatte ganger med en 1 ml pipettespiss. Bruk en batteridrevet pipetteholder utstyrt med en 50 ml pipette for å filtrere cellesuspensjonen gjennom en 100 μm cellesil tilbake i 50 ml plastrøret og sentrifuger den ved 350 x g i 5 minutter ved RT.
    7. Fjern supernatanten, resuspender pelleten i 10 ml lyseringsbuffer for røde blodlegemer (RBC) og sentrifuger igjen ved 350 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    8. Resuspender pelleten i 5 ml makrofagkulturmedium (DMEM / F12 + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin + 1% amfotericin + 1% ikke-essensielle aminosyrer) og frø den til ubehandlede petriskåler med en diameter på 100 mm (5-8 x 106 celler per tallerken).
    9. Etter 4 timer tilsettes 5 ml makrofagkulturmedium tilsatt 40 ng/ml makrofagkolonistimulerende faktor (m-CSF) til cellekulturmediet uten m-CSF (1:1-blanding) for å komme til en endelig konsentrasjon på 20 ng/ml m-CSF.
    10. Etter 6 dager, bruk cellene i eksperimenter eller frys dem til videre bruk. Bruk en celle detachment løsning annet enn trypsin (Table of Materials) for å fjerne cellene fra vevskultur plast.
      MERK: Når cellene er isolert, utvider de seg ikke lenger. Celleisolasjonsmetodene beskrevet her fungerer også med mus og rotter utenfor det angitte aldersområdet.
  8. For å verifisere fenotypen til de isolerte cellepopulasjonene med flowcytometri, fortsett med trinn 6.3.4.

2. Kollagenisolering fra Wistar- eller Sprague-Dawley-rotter

  1. Følg isolasjonsprotokollen beskrevet i detalj andre steder86. Det fungerer også med mus, om enn med et mye lavere utbytte.
  2. Bestem konsentrasjonen av den resulterende løsningen med en hydroksyprolinanalyse, vurder renheten med SDS-side, og lagre løsningen ved 4 ° C til bruk i forsøkene.

3. Produksjon av kultursystemkomponentene

  1. 3D-print klemmeholderne, monteringsstasjonen og kammerformene.
    1. Legg den vedlagte .stl-filen (tilleggsfil 1) for klemmeholderne, monteringsstasjonen og kammerformene inn i kutteprogramvaren. Hvis du vil tilpasse objektnumrene etter behov, bruker du pek og klikk for å markere objekter og kopiere og lime inn for å multiplisere dem.
    2. Trykk på Eksporter G-kode (Ctrl-R) for å generere G-koden og deretter eksportere den (Ctrl-G).
    3. Legg G-koden i en 3D-skriver.
    4. Bruk ufargede, biokompatible filamenter til trykkeprosessen (dvs. polymelkesyre).
    5. Skjær 3 mm gjenger inn i hullene på klemmeholderen som skal bære skruene ved hjelp av en gjengekutter (tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3, hull 1 og 3).
    6. Sett pluggpinner i rustfritt stål inn i hullet på baksiden av klemmeholderen (tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3, hull 4).
    7. Steriliser klemmeholderne og monteringsstasjonen med UV-lys i minst 1 time før bruk. Ikke bruk 3D-printede klemmeholdere på nytt.
    8. Alternativt kan du produsere klemmeholderne og monteringsstasjonen med polyeterimid ved hjelp av vedlagte planer (tilleggsfil 2, tilleggsfil 3 og tilleggsfil 4), som er dyrere, men muliggjør bedre steriliseringsmetoder (dvs. autoklavering) og gjentatt bruk.
  2. Støp kamrene ved hjelp av 3D-printede former.
    1. Fyll kammerformene med silikon.
    2. Degas silikonet i et vakuumkammer (90 mbar) i 30 minutter.
    3. La løsningen polymeriseres ved RT over natten eller på en kokeplate ved 70 °C i 1 time, avhengig av varmebestandigheten til filamentene som brukes til formene.
    4. Fjern forsiktig de polymeriserte kamrene fra formene og kutt bort overflødig silikon med en skalpell (nr. 21).
    5. VALGFRITT: Hvis assembloidene og dermed de omkringliggende kamrene skal belastes mekanisk, forsterk hullene i silikonkamrene med hule rør laget av rustfritt stål.
  3. Maskin metallklemmene fra rustfritt stål ved hjelp av vedlagte plan (tilleggsfil 5).
  4. Før hver bruk, vask klemmene i rustfritt stål, polyeterimidklemmeholderne, skruene og silikonkammeret.
    1. Sonikere i 10 minutter i 80% etanol (EtOH) og 20% omvendt osmose vann (ROW).
    2. Sonikere i 10 minutter i 50% EtOH og 50% isopropanol.
    3. Skyll 3x med ROW.
    4. Sonikere i 10 minutter i 0,5% alkalisk rengjøringskonsentrat (dvs. 3 ml i 600 ml rad).
    5. Sonikere i 10 minutter i 0,5% alkalisk rengjøringskonsentrat.
    6. La stå i 0,5% alkalisk rengjøringskonsentrat mens du rister i 1 time 50 min.
    7. Skyll 3x med ROW.
    8. Sonikere i 10 min på rad.
    9. Lufttørk komponentene og autoklav dem.

4. Klemme kjerneeksplantene

  1. Plasser matchende klemmeholdere sammen med en metallklemme hver i monteringsstasjonen.
  2. Plasser våte autoklaverte papirbiter (4 mm x 25 mm) på toppen av metallklemmene og kutt deretter papiret langs klemmenes indre kanter med en skalpell (nr. 21). Klipp bort 2 ekstra, mindre papirbiter (4 mm x 1,5 mm) fra et annet papirstykke og hold dem våte.
  3. Bruk spiss pinsett til å plassere 8 kjerneeksplanter på papiret mellom metallklemmene med endepunktene på metallklemmene.
  4. Dekk endepunktene til kjerneeksplantene med de klargjorte mindre papirbitene (4 mm x 1,5 mm) og legg deretter metallklemmer på toppen av dem. Bruk en skrutrekker og de små skruene (M3 x 6 mm) for å feste kjerneeksplantene mellom metallklemmene og klemmeholderen.
  5. Overfør forsiktig de klemte kjerneeksplantene til silikonkulturkamrene og fyll disse kamrene med 2 ml standard cellekulturmedium (DMEM / F12 + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin + 1% amfotericin + 1% ikke-essensielle aminosyrer).
  6. VALGFRITT: Hvis assembloidene/de omkringliggende kamrene skal belastes mekanisk, fikseres de med ekstra skruer (M3 x 16 mm) i hull 3 (tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3, hull 3).

5. Kollagenhydrogelfremstilling og støping

  1. Fjern målcellene fra vevskulturplasten med celleavløsningsløsning, sentrifuge dem ved 400 x g i 5 minutter ved RT, og resuspender dem i 1 ml standardkulturmedium.
  2. For en assembloid kreves 10 μL PBS (20x), 1,28 μL 1 M NaOH (125x), 8,72 μL dobbeltdestillert vann (ddH2O, 23x), 80 μL kollagen-1 (2,5x eller 1,6 mg / ml final) og 100 μL (2x) standardkulturmedier (for kjerne // cellefrie assembloider) eller cellesuspensjon. Forbered disse komponentene i to separate løsninger og bland dem bare umiddelbart før støpingen.
    1. Kryssbindingsløsning: Slå sammen PBS, NaOH, ddH20 og cellesuspensjonen på opptil 12 assembloider (+10 % sikkerhetsmargin) i en tverrbindingsløsning og oppbevar den i et 15 ml plastrør på is. Juster konsentrasjonen av cellesuspensjonen for å oppnå følgende endelige konsentrasjoner etter blanding av de to løsningene: 250 000 celler / ml senefibroblaster, 500 000 celler / ml muskelavledede endotelceller eller 370 000 celler / ml benmargsavledede makrofager.
    2. Kollagen-1-løsning: Samle kollagen-1-løsningen som kreves for opptil 12 assembloider (+10% sikkerhetsmargin) i et annet 15 ml plastrør og hold det på is.
  3. Når tverrbindingsløsningen og kollagen-1-løsningen er klar på is, aspirerer cellekulturmediet fra kulturkamrene som inneholder de klemte kjerneeksplantene.
  4. Tilsett kollagen-1-løsningen til tverrbindingsløsningen med en 1000 μL pipette og bland de to løsningene ved å pipettere raskt opp og ned uten å skape bobler. Dekk de enkelte senekjerneplantene med 200 μL av den blandede løsningen ved å pipette den inn i lundene som leveres av silikonkamrene.
  5. La hydrogelene polymerisere i 50 minutter ved 37 °C.
  6. Fyll silikonkulturkamrene forsiktig med 1,5 ml av det respektive kokulturmediet ved å pipetere det i hjørnene av kamrene.
    1. For kjerne // fibroblast co-kultur, fyll DMEM / F12, 10% FBS, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% penicillin / streptomycin, 1% amfotericin, 200 μM L-askorbinsyre, 20 ng / ml makrofagkolonistimulerende faktor.
    2. For kjerne // makrofag kokultur, fyll DMEM / F12, 10% FBS, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% penicillin / streptomycin, 1% amfotericin, 200 μM L-askorbinsyre, 20 ng / ml makrofagkolonistimulerende faktor.
    3. For kjerne // endotelcelle kokultur, fyll 1: 1 blanding av DMEM / F12 og endopan 3-settet + 10 U / ml heparin + 20% FBS + 1% penicillin / streptomycin + 1% amfotericin + 30 mg / ml endotelveksttilskudd.
  7. Kultur assembloidene i kulturbetingelsene som passer for hypotesen. For å etterligne et lesjonslignende nisjemiljø, for eksempel, dyrk dem ved 37 ° C og 20% O2. Endre kulturmediet to ganger på 1 uke. For å forhindre infeksjoner, legg kamrene i en stor petriskål eller en steril boks før du legger dem inn i en inkubator.
    MERK: Kulturtiden avhenger av hypotesen og samkulturoppsettet. For eksempel blir kjerne // fibroblast assembloider i et lesjonslignende nisjemiljø mekanisk ustabile etter ca. 3 uker.

6. Tilgjengelige avlesningsmetoder

  1. Utfør fluorescensmikroskopi, inkludert levedyktighets- og morfologianalyser.
    1. Generelt kan assembloidene avbildes som fulle monteringer. For å gjøre det, fjern assembloidene fra klemmene ved å kutte dem med saks nær klemmene og overføre dem til en 12-brønnsplate.
    2. Vask assembloidene en gang med PBS.
    3. Hvis levedyktighetsanalyse utføres, beis hver assembloid med 100 μL 4 x 10-6 M ethidiumhomodimer i PBS (EthD-1) i 20 minutter ved 37 °C i mørket.
    4. Vask assembloidene 3x med PBS, og fest dem deretter med 500 μL 4% formaldehyd hver i 20 minutter ved RT.
      FORSIKTIG: 4% formaldehyd har allergifremkallende, kreftfremkallende og mutagene effekter, er giftig for reproduksjon og kan forårsake utviklingstoksisitet (reproduksjonstoksisk) eller skade på organer. Bruk verneklær og hansker, øyevern og maske eller annet pustevern.
    5. Vask assembloidene 3x med PBS og fortsett med den valgte fargeprotokollen. Et utvalg flekker er beskrevet tidligere84,85.
      MERK: Unngå farginger som bruker fluorforer med en emisjonsbølgelengde nær kollagenautofluorescens (rundt 480 nm).
  2. I henhold til produsentens instruksjoner, utfør romspesifikk RNA-isolasjon for RT-qPCR eller genom-wide RNA-sekvensering.
    1. Fjern assembloidene fra klemmene med saks.
    2. VALGFRITT: Bruk pinsett til å skille kjerneeksplantene fra det ytre hydrogelrommet.
    3. Basseng 20-24 20 mm kjerneeksplanter eller 2 cellebelastede kollagenhydrogeler for å isolere tilstrekkelige mengder RNA.
    4. Bruk 1 ml kald trizol og mekanisk forstyrrelse (dvs. metallperler eller kryogen sliping) for å ødelegge den ekstracellulære matrisen til de samlede kjerneeksplantene eller de samlede kollagenhydrogelene.
      FORSIKTIG: Oral, dermal og innånding toksisitet. Forårsaker hud- og øyeirritasjon. Håndteres kun med hansker og i et kjemisk sikkerhetsskap.
    5. Fortsett med RNA-isolering fra cellelysatet ved hjelp av standard RNA-ekstraksjonssett som beskrevet tidligere eller som beskrevet i produsentens instruksjoner84,85.
  3. Avdelingsspesifikk flowcytometri.
    1. Fjern assembloidene fra klemmene med saks.
    2. VALGFRITT: Bruk pinsetten til å skille kjerneeksplantene fra det ytre hydrogelrommet.
    3. Fordøye rom i 1 ml PBS med kollagenase I (3 mg/ml) og dispase II (4 mg/ml) i 4 timer ved 37 °C under konstant omrøring.
    4. Sentrifuger den fordøyde oppløsningen ved 500 x g i 5 minutter ved RT og aspirer supernatanten.
    5. Resuspender pelleten i 100 μL FACS-buffer (1% FBS i PBS) som inneholder de fluoroforkonjugerte antistoffene du velger. Et utvalg av arbeidende fluoroforkonjugerte antistoffer er beskrevet tidligere84,85.
    6. Inkuber fargeløsningen i 30 min ved RT.
    7. Fortynn fargeløsningen med 1,4 ml FACS-buffer og sentrifuge den i 5 minutter ved 500 x g ved RT.
    8. Suspender pelleten i 350 μL FACS-buffer og filtrer løsningen gjennom en 100 μm silhette av nylonnett før du analyserer den med det valgte strømningscytometeret i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Analyser supernatanten.
    1. Bytt ut samkulturmediet med serumfritt samkulturmedium 3 dager før supernatantkolleksjonen.
    2. Utfør umiddelbar og forsinket analyse av den berikede, ufortynnede supernatanten med enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og mesoskalaoppdagelsessett (MSD). For forsinket analyse, oppbevar supernatanten i 1,5 ml plastrør ved -80 °C.
  5. Vurdere assembloid mekaniske egenskaper.
    1. Bruk en skreddersydd strekkanordning til å påføre mekaniske krefter og måle mekaniske egenskaper22. Dowel-pinnene i rustfritt stål og skruene i rustfritt stål gjør klemmene festbare til andre strekkanordninger også.
    2. Siden de mekaniske egenskapene til assembloiden i stor grad bestemmes av egenskapene til den innebygde kjerneeksplanten 18, måles de mekaniske egenskapene til kjerneeksplanten før den legges inn i en hydrogel for å redusere risikoen for å ødelegge den nystøpte hydrogelen i måleprosessen.

Representative Results

Komponentisolering (figur 1 og figur 2)
Før bruk av kjerneeksplanter og cellepopulasjoner i assembloid kokultur, skal disse komponentene kontrolleres under mikroskopet (figur 1). Kjerneplanter skal ha en jevn diameter (100-200 μm) og ingen synlige knekk eller rynker. Endotelceller skal presentere en langstrakt form i kontakt med andre celler, noe de ikke gjør når de blir sådd med for lav tetthet på grunn av et lavt startutbytte fra isolasjonen. I dette tilfellet antar endotelcellene en mer rundaktig form med cytoskeletale utvidelser og prolifererer markant langsommere. Del dem 1:5 etter 7-10 dager. Senefibroblaster isolert fra akillessenene antar en mer rund morfologi sammenlignet med deres menneskelige kolleger innen 1-2 passasjer (10-14 dager hver) da de ble delt 1: 6. Makrofager er mye mindre enn fibroblaster eller endotelceller og sprer seg ikke etter isolasjonen. Avhengig av batchen, kan formen variere fra pyramidal til rund.

Fenotypene til cellekomponentene ble verifisert med flowcytometri. Et konjugert CD31-antistoff ble brukt som markør for endotelceller (figur 2A). Ved innstilling av fluorescensgrensen basert på en ufarget kontrollprøve (grå), ble 90,1 % av passasje 1 (P1) og 48,7 % av endotelceller i passasje 2 (P2) identifisert som CD31-positive. En genetisk modifisert muselinje som samtidig uttrykker senefibroblastmarkøren Scleraxis sammen med et grønt fluorescerende protein (ScxGFP) og et konjugert CD146-antistoff ble brukt til å karakterisere senefibroblastene (figur 2B)35,60. Etter én passasje (P1) var 37,3 % av fibroblastene ScxGFP+CD146-, 0,2 % ScxGFP+CD146+, 4,3 % ScxGFP-CD146+ og 58 % ScxGFP-CD146-. Etter to passeringer (P2) ble prosentandelen av ScxGFP+CD146-celler redusert til 27,6 %, prosentandelen av ScxGFP+CD146+-celler økte til 6,9 %, prosentandelen av ScxGFP-CD146+-celler økte til 10,6 %, og prosentandelen av ScxGFP-CD146-celler gikk ned til 54,9 %. For å identifisere og karakterisere makrofagene ble det brukt et F4/80-antistoff i kombinasjon med et CD86- og et CD206-antistoff (figur 2C). Etter isolering og dyrkning var 96,4 % av benmargsderiverte celler F4/80-positive. Blant disse F4/80-positive cellene var 8,6 % CD206+CD86-, 23,6 % CD206+CD86+, 28,3 % CD206-CD86+ og 39,4 % CD206-CD86-. Kollagen kryssbindingshastighet kan variere fra batch til batch og skal testes før du starter eksperimenter.

Assembloid utseende (figur 3)
Under lesjonslignende kulturforhold (36 °C, 20 %O2) forble kjerneeksplanten mekanisk strekkbar, endret ikke utseende og fortsatte å være visuelt atskilt og fysisk separerbar fra den omkringliggende hydrogelen i minst 21 dager (figur 3A,B). Den omkringliggende hydrogelen ble komprimert over tid, med komprimeringshastigheten avhengig av cellepopulasjonen som ble sådd inn i den. Achilles-seneavledede fibroblaster kontraherte deres omkringliggende hydrogel raskest og gjorde det radialt når de var i en hydrogel kastet rundt en kjerneanlegg og i alle retninger når de ikke var det (figur 3B, C). I utgangspunktet komprimerte cellefrie hydrogeler plassert rundt en kjerneeksplante også. Denne sammentrekningen var sannsynligvis forårsaket av migrerende celler fra kjerneanlegget, noe som indikerer et dynamisk tverrkompartmentalt grensesnitt. Siden cellefrie hydrogeler uten en innebygd kjerneeksplantasjon ikke komprimerte detekterbart, synes bidraget fra vanntap-indusert krymping å være ubetydelig (figur 3B og tilleggsfil 6).

Mangel på hydrogelkomprimering kan derfor brukes til å oppdage feil i assembloidenheten (dvs. lave cellekonsentrasjoner) og bør kontrolleres før du fortsetter med dyrere avlesningsmetoder. Mens denne metoden ble etablert, inkluderte vanlige feil som reduserte cellekonsentrasjonen døende celler i den ytre hydrogelen fordi de ble liggende for lenge i den relativt harde tverrbindingsløsningen (høy pH, lav temperatur) og tørkekjerneplanter fordi tiden mellom medium aspirasjon og hydrogelinjeksjon var for lang, eller fordi kjerneeksplanten ble klemmet for høyt til å bli innebygd i kollagenet.

Konfokal fluorescensmikroskopi: Levedyktighets- og morfologianalyse (figur 3)
Når de er fjernet fra klemmene med saks (figur 3B), kan assembloider festes, farges og avbildes med et konfokalmikroskop som helhet uten seksjonering. Her ble kjerne // endotelcelle, kjerne // makrofag og kjerne // fibroblastassembloider farget med DAPI (NucBlue) og Ethidium Homodimer (EthD-1) for å analysere levedyktigheten og DAPI og F-aktin for å analysere morfologi og cellespredning i 3D-kollagenhydrogelen (figur 3D). Levedyktigheten til kjerne // endotelcellemontoider (figur 3E) ble kvantifisert og funnet å være generelt lavere etter assembloidmontering enn tidligere rapportert for kjerne // makrofag og kjerne // fibroblast assembloider84. Imidlertid forble levedyktigheten stabil under assembloidkultur til minst dag 7.

Mekanisk indusert mikroskade og måling av mekaniske egenskaper (figur 4)
Skruene og pinnene festet til klemmeholderne tillater fiksering av klemmeformede assembloider til uniaxiale strekkeinnretninger. Den skreddersydde strekkanordningen som brukes her, er utstyrt med en 10 N lastcelle og har blitt beskrevet i tidligere publikasjoner (figur 4A) 22. Alle prøvene var forhåndskondisjonert med fem strekksykluser til 1% belastning før målingene.

Registrering av hele spenning-tøyningskurven for kjerneeksplanter eller assembloider (figur 4B) vil tillate kvantifisering av den lineære elastiske modulen (α), maksimal belastning (β) og maksimal belastning (у). Imidlertid skader det også irreversibelt kjerneeksplanten eller assembloiden, noe som gjør det umulig å vurdere den langsgående utviklingen av maksimal belastning (β) og maksimal belastning (у) for de samme prøvene (figur 4B). Her ble den lineære elastiske modulen brukt som et mål for prøvens evne til å motstå krefter, da denne målingen krever at prøven strekkes til bare 2% belastning, noe som tidligere har vist seg å ikke forårsake permanente reduksjoner i den lineære elastiske modulen18. Spesielt ble kjerne // endotelcellemontoider utsatt for klemmeprosedyren til 2% belastning (omtrent slutten av den lineære elastiske regionen) eller 6% belastning (omtrent maksimal belastning). Den resulterende mikroskaden ble vurdert ved å måle den lineære elastiske modulen før og etter prosedyren (figur 4C).

I tråd med tidligere utførte eksperimenter som utnyttet monodyrkede kjerneeksplanter, beholdt kjerne // endotelcelleassembloider sin lineære elastiske modul i minst 14 dager når de ble dyrket i kvasi-homeostatiske nisjeforhold (29 ° C, 3% O2) og utsatt for stammer ikke høyere enn 2%18,21. Når det gjelder mekanisk baseline-stimulering, syntes den statiske strekningen som ble påført gjennom klemmene å etterligne innfødte belastningsnivåer som oppleves av senekjerneenheter in vivo for å forhindre katabolske prosesser som generelt er forbundet med matriseavlastning87. Faktisk kan den progressive og statistisk signifikante nedgangen i den lineære elastiske modulen observert i kjerne // endotelcelleassembloider utsatt for 6% belastning tilskrives matriseavlastningen som stammer fra mekanisk indusert matriksmikroskade.

Når du utfører disse forsøkene, er det viktig å forhindre tørking av assembloidet. Her ble de innkapslet i autoklavert og fuktet papir, men andre metoder kan også være levedyktige avhengig av deres kompatibilitet med strekkanordningen som brukes. Siden friksjonen mellom metallklemmene og kjerneeksplanten er begrenset, må du legge til små papirbiter mellom metallet og kjerneanlegget under klemming for å forhindre glidning og nøye overvåke strekkprosessen for å oppdage og utelukke forskyvning av kjerneplanter og assembloider.

Kompartmentspesifikt transkriptom og assembloidspesifikk sekretomanalyse (figur 5 og figur 6)
I det første settet av kjerne-monokultureksperimenter som presenteres her, ble stabiliteten av kjernegenuttrykk etter eksplantisolering vurdert for å frikoble isolasjon fra eksperimentelle effekter (figur 5A). Selv om høyere replikatall er nødvendig for presise konklusjoner, økte uttrykket av Vegfa og Mmps sterkt i nyisolerte kjerneeksplanter innen timer etter eksplantisoleringen når de ble dyrket i lesjonslignende nisjeforhold (37 °C, 20% O2).

Neovaskularisering er et sentralt kjennetegn på senesykdom og reparasjon som delvis kan drives av endotelceller aktivert av pro-angiogene faktorer (dvs. vaskulær endotelial vekstfaktor, Vegfa) utskilt av senekjernen under hypoksi88. Ved å undersøke det første trinnet i denne potensielle crosstalken (figur 5B), ble uttrykket av både Vegfa og hypoksimarkøren karbonanhydrase 9 (Ca9) funnet å være økt statistisk signifikant i eksplanter monodyrket under lav oksygenspenning (3% O2) i motsetning til de monodyrkede under høy oksygenspenning (20% O2). I mellomtiden syntes den lavere oksygenspenningen ikke å forårsake endringer i uttrykket av senfibroblastmarkører som Scleraxis (Scx) og kollagen-1 (Col1a1). Sammen identifiserer disse resultatene kjerne-residente celler som plausible bidragsytere til pro-angiogen signalering i en hypoksisk nisje.

Deretter ble aktiveringen av endotelceller ved pro-angiogen kjernesignalering vurdert i kjerne // endotelcelle assembloid kokultur under høy (20% O2) og lav (3% O2) oksygenspenning. Heldigvis tillater den modulære sammensetningen av assembloider romspesifikk transkriptomanalyse etter kultur ved fysisk å separere kjerneanlegget fra den ekstrinsiske kollagenhydrogelen (figur 6A). I kjerneeksplanten (figur 6D) ble Vegfa-uttrykk igjen bekreftet å øke under lav oksygenspenning, selv om effekten på andre hypoksiske markører som Fgf2 var mindre klar og krever høyere replikate tall for presise konklusjoner. I tillegg ble ekspresjonen av proinflammatoriske markører som Tnf-α og markører for ekstracellulær matriksnedbrytning som Mmp3 redusert i kjernen under lav oksygenspenning. I den ekstrinsiske hydrogelen som opprinnelig ble sådd med endotelceller (figur 6E), reduserte tilstedeværelsen av en levende kjerneeksplante (aC) Vegfa-uttrykk under lav oksygenspenning, men ikke under høy oksygenspenning. I tillegg reduserte tilstedeværelsen av en devitalisert (dC) kjerneeksplante under lav oksygenspenning heller ikke Vegfa-uttrykket . Under lav oksygenspenning var Tnf-α-ekspresjon i den ytre hydrogelen sammenlignbar rundt aC / dC, men økte under høy oksygenspenning rundt levende kjerneeksplanter. Fgf2-ekspresjon ble redusert under alle forhold sammenlignet med den ekstrinsiske endotelcellebelastede hydrogelen dyrket rundt en devitalisert kjerneeksplant under høy oksygenspenning, men mest under lav oksygenspenning. Mmp3-uttrykket var høyest rundt levende kjerneeksplanter under høy oksygenspenning og lavest rundt devitaliserte kjerneeksplanter under lav oksygenspenning. Samlet sett synes de samdyrkede endotelcellene å reagere på både den aktive kjerneeksplanten, som er i stand til å initiere crosstalk og variasjoner i oksygennivå. En mer omfattende transkriptomanalyse vil gjøre det lettere å belyse deres respektive bidrag.

Modulariteten til assembloidsystemet tillater integrering av genetisk modifiserte celler som inneholder fluorescerende reportergener. Her ble endotelceller isolert fra Pdgfb-iCreER mG-mus89 sådd inn i hydrogelrommet. Disse cellene uttrykker samtidig endotelcellemarkørens blodplateavledede vekstfaktorunderenhet b (Pdgfb) sammen med det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (EGFP), noe som gjør at Pdgfb-uttrykkende endotelceller virker grønne under mikroskopien (figur 6C). Ved hjelp av denne metoden ble tilstedeværelsen av Pdgfb-uttrykkende endotelceller bekreftet å være opprettholdt over 7 dager i kultur (37 °C) og syntes å være uavhengig av oksygenspenning (20%O2 sammenlignet med 3% O2).

For å analysere sekretomet til assembloider ble kulturmediet som ble brukt henholdsvis for kjerne // cellefri og kjerne // fibroblast, kjerne // makrofag eller kjerne // endotelcelle-samkultur erstattet med sin serumfrie motpart tre dager før aspirering og frysing av supernatanten som nå er beriket med sekresjonen (figur 6A). Denne anrikningstiden var tilstrekkelig til å påvise cytokiner som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) med en MSD-analyse, som vist her for kjerneeksplanter og kjerne // fibroblastassembloider dyrket i lesjonslignende nisjeforhold (figur 6B).

Viktige hensyn ved analyse av sekretomer og transkriptomer av kjerneplanter og assembloider gjelder bruken av riktige kontroller. Ferskt isolerte kjerneplanter har begrenset verdi, da spesielt uttrykket av Vegfa og Mmps øker sterkt i løpet av timer etter isolasjonen (figur 5A). Tidsmatchede eksplanter omgitt av en opprinnelig cellefri hydrogel er mer egnet som kontroller for kjerneromsgenuttrykket. For den ytre hydrogelen er cellebelastede hydrogeler dyrket uten kjerneeksplantasjon dårligere kontroller sammenlignet med cellebelastede hydrogeler dyrket rundt devitaliserte kjerneeksplanter (tilleggsfil 7), hovedsakelig fordi de komprimeres til runde former i stedet for langstrakte hydrogeler som i stor grad endrer cellemorfologien (figur 3A).

Figure 1
Figur 1: Assembloid komponentisolering og montering til modell in vivo crosstalk. Senekjerneplanter ble hentet fra musehaler, kuttet og klemt. Musbensmuskler (dvs. quadriceps femoris (QF), gastrocnemius (G) og tibialis anterior (TA)) ble fordøyd for å isolere endotelceller som deretter ble dyrket på vevskulturplast. Akillessenene (AT) ble også fordøyd for å isolere senefibroblaster, som deretter ble dyrket på vevskulturplast. Benmargen fra tibia og lårbenet ble skylt ut av knoklene. Deretter ble de isolerte monocyttene dyrket på vevskulturplast og differensiert til naive makrofager. Lysmikroskopibildene (10x) viser utseendet til kjerneeksplanter, endotelceller, senefibroblaster og makrofager umiddelbart før de integreres i assembloider. Under monteringen ble cellene dyrket på plast satt i suspensjon og deretter sådd til en kollagen-1-løsning (1,6 mg / ml). Deretter ble celle-hydrogelblandingen støpt rundt den klemte kjerneeksplanten og polymerisert i 50 minutter ved 37 ° C før tilsetning av kulturmedium. Dyrkningsbetingelsene ble styrt via klemmene (mekanisk spenning) og inkubatorinnstillingene (oksygenkonsentrasjon, temperatur). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av cellulære assembloidkomponenter. (A) Representativ flowcytometrisk analyse av muskelderiverte endotelceller etter en passasje (P1, øverste rad) og to passasjer (P2, nederste rad). Verdiene for ufargede (grå) og CD31-fargede (grønne) celler ble normalisert til modale. Prosentandelene er gitt for den CD31-fargede gruppen. (B) Representativ flowcytometrisk analyse av akillessenderiverte fibroblaster etter en passasje (P1, øverste rad) og to passasjer (P2, nederste rad). Aksene rapporterer fluorescensintensiteter av ufargede celler (grå) og celler som begge uttrykker ScxGFP og farget med CD146-antistoffer (regnbuefarger). (C) Representativ flowcytometrisk analyse av benmargsderiverte makrofager etter dyrkning. I øverste rad ble tellingene for ufargede (grå) og F4/80-fargede (grønne) celler normalisert til modale. Prosentandelene er gitt for gruppen F4/80-farget. Grafen i nederste rad rapporterer fluorescensintensiteter av ufargede celler (grå) og F4/80+ -delmengden av celler farget med CD206-antistoffer og CD86-antistoffer (regnbuefarger). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Assembloid avbildning og utseende. (A) Representative fotografier tatt på dag 0 (d0) og dag 21 (d21) av kultur (37 ° C, 20% O2) viser en flerdimensjonal sammentrekning av en hydrogel som inneholder ytre fibroblaster uten en innebygd kjerneeksplantasjon og sterk radial komprimering av en hydrogel som inneholder ytre fibroblaster rundt en kjerneplant. (B) Representative fotografier tatt på dag 21 (d21) av kultur (37 ° C, 20% O2) viser forskjeller i komprimeringshastighet mellom cellefrie hydrogeler, cellefrie hydrogeler kastet rundt en kjerneeksplantasjon og senfibroblastbelastede hydrogeler kastet rundt en kjerneeksplant. (C) De representative lysmikroskopibildene (10x) tatt på dag 0 (d0) og dag 21 (d21) av kultur (37 ° C, 20% O2) indikerer langsgående endringer i tilstedeværelsen av cellepopulasjoner og komprimeringshastigheten til kollagenhydrogelen (HG) rundt kjerneeksplanten (E) i kjerne // cellefri og kjerne // fibroblast assembloid samkultur. Den skjematiske fremstillingen viser forskjellene i hydrogelkomprimering mellom kjerne // cellefri assembloid og kjerne // fibroblast assembloid kokultur. (D) Representative konfokale mikroskopibilder tatt på dag 7 (d7) av kjerne // endotelcelle, kjerne // makrofag og kjerne // fibroblast assembloid kokultur (37 °C, 20 %O2). Bilder i venstre rad viser assembloider med cellekjerner farget i blått (DAPI) og døde celler farget i rosa (Ethidium homodimer-1). De to andre radene viser assembloider med cellekjerner farget i blått (DAPI) og aktinfilamenter i grønt (F-aktin). (E) Boxplots som viser den kvantifiserte levedyktigheten til kjerne // endotelcelleassembloider på dag 1 (d1) og dag 7 (d7) av samkultur. N = 5. De øvre og nedre hengslene tilsvarer første og tredje kvartil (25. og 75. prosentil ) og den midterste til medianen. Værhår strekker seg fra øvre/nedre hengsel til største/minste verdi ikke lenger enn 1,5 ganger interkvartilområdet. P-verdier: n.s.p > 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mekanisk stimulering av assembloider og måling av assembloidmekaniske egenskaper. (A) Grafisk avbildning av den skreddersydde strekkanordningen som består av klemmeholderplattformene, en kraftsensor og en trinnmotor. Det fotografiske bildet viser en assembloid montert på strekkanordningen med klemmer. Lokket på et 15 ml plastrør (Ø: 17 mm) som brukes til kalk. (B) Graf som viser representative spennings-/tøyningskurver for kjerneplanter (lyseblå) og assembloider (lys rød). Den lineære elastiske modulen (α), maksimal belastning (β) og maksimal belastning (у) kan ekstraheres fra dataene for å mekanisk karakterisere kjerneeksplanten eller assembloiden. (C) Graf som viser den lineære elastiske modulen (Emod) av kjerne // endotelcellemontoider som er dyrket samtidig (29 ° C, 3% O2) over et 14-dagers tidsforløp etter å ha blitt klemmet (fast linje), klemmet og strukket til 2% L0 belastning (stiplet linje), eller klemmet og strukket til 6% L0 belastning (stiplet linje) ved starten av forsøket. N = 5. Datapunktene ble normalisert til den opprinnelige modulen lineær elastisk modul før strekkingen og vises alle som gjennomsnitt (±sem). P-verdier: *p < 0,05, **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5 Forandringer i kjernetranskriptomet etter isolasjon og dyrkning under ulike nisjebetingelser. (A) Scatterplot som viser foldeendringene i Vegfa, Mmp13 og Mmp3 genuttrykk i mono-kulturerte (37 ° C, 20% O2) murine core explants 2 timer, 4 timer, 6 timer og 8 timer etter å ha isolert dem fra halen. Foldeforandringene på de respektive tidspunktene ble normalisert til genuttrykket 2 timer etter isoleringen. N = 2. (B) Boxplots som skildrer foldeendringene i Ca9, Vegfa, Scx og Col1a1 genuttrykk i kjerneeksplanter monodyrket under lav oksygenspenning (3% O2) normalisert og sammenlignet med de monodyrkede under høy oksygenspenning (20% O2). N = 5-6. De øvre og nedre hengslene i boksplottene tilsvarer første og tredje kvartil (25. og 75. persentil) og den midterste til medianen. Værhår strekker seg fra øvre/nedre hengsel til største/minste verdi ikke lenger enn 1,5 ganger interkvartilområdet. Datapunkter som brukes til normalisering, vises som svarte prikker og individuelle datapunkter som røde prikker. P-verdier: **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6 Assembloidspesifikt sekretam- og kompartmentspesifikt transkriptomanalyse. (A) Representativt fotografi som viser assembloiden på dag 7 (d7), da sekretom- og transkriptomprøver ble tatt, og avbildning av den underliggende arbeidsflyten. (B) VEGF-konsentrasjon (pg/ml) i supernatanten av kjerne // cellefri og kjerne // fibroblastassembloider etter 7 dager med samkultur (37 °C, 20%O2) avbildet som boksplott. N = 6. (C) Representative konfokalmikroskopibilder av kjerne // endotelcelleassembloider etter 7 dagers samkultur (37 °C) under høy oksygenspenning (20%O2) og lav oksygenspenning (3%O2). Cellekjerner er farget i blått (DAPI), og de innebygde endotelcellene uttrykker samtidig forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) sammen med endotelcellemarkøren blodplateavledet vekstfaktorunderenhet b (Pdgfb). Den stiplede linjen indikerer det kompartmentale grensesnittet mellom kjerneeksplanten (E) og endotelcellebelastet hydrogel (HG). (D) Scatterplot som viser foldeendringene i Vegfa-, Tnf-α-, Fgf2- og Mmp3-genuttrykk i kjernerommet fra kjerne // endotelcelleassembloider dyrket sammen under lav oksygenspenning (3% O2) normalisert og sammenlignet med de som dyrkes under høy oksygenspenning (20% O2). N = 2. (E) Scatterplot som viser foldeendringene i Vegfa-, Tnf-α-, Fgf2- og Mmp3-genuttrykk i det ytre rommet i kjerne // endotelcelleassembloider med en levende kjerne (aC) eller en devitalisert kjerne (dC) dyrket sammen under høy oksygenspenning (20%O2) og lav oksygenspenning (3%O2). Foldendringene i de respektive forholdene ble normalisert til det ytre rommet i en kjerne // endotelcelleassembloid med en devitalisert kjerne (dC) dyrket sammen under høy oksygenspenning (20%O2). N = 3-4. I B tilsvarer de øvre og nedre hengslene i boksplottene den første og tredje kvartilen (25. og 75. persentil) og den midterste til medianen. Whiskers strekker seg fra øvre / nedre hengsel til den største / minste verdien ikke lenger enn 1,5 ganger interkvartilområdet. Uteliggere er avbildet som svarte prikker. P-verdier: *p < 0,05. I D og E vises datapunktene som brukes til normalisering, som svarte prikker, og individuelle datapunkter vises som røde prikker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Inngangskrav til senesykdom og skademodellsystemer. En liste over primære senesykdomsutløsere og sekundærdrivere matchet til et utvalg av inngangsparametere hvis trekkbarhet er sentral for modellering av senesykdom og skade. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Utgangskrav for systemer for senesykdom og skademodeller. Et utvalg kjennetegn ved senesykdom matchet et utvalg utgangsparametere hvis kvantifiserbarhet er sentral for tolkning av senesykdom og skademodellatferd. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: .stl-fil for klemmeholderne, monteringsstasjonen og kammerformene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Plan over høyre klemmeholder. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Plan for venstre klemmeholder. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Plan for monteringsplattformen Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: Plan over metallklemmer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: Bilde som viser cellefri hydrogelkrymping. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 7: Bilde som viser en devitalisert kjerneeksplant. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Samlet sett har assembloidmodellsystemet som presenteres her flere kritiske trinn å fremheve. For det første er modellsystemet bare så godt som kvaliteten på komponentene. Det er viktig å sjekke kjerneeksplanten og de sådde cellepopulasjonene under mikroskopet før monteringsprosessen starter. Det er tilsvarende viktig å verifisere fenotypen til de isolerte cellepopulasjonene minst én gang med flowcytometri. Spesielt når en ny gruppe kollagen-1 brukes for første gang, er det fordelaktig å sjekke kryssbindingshastigheten i en prøvekjøring før du legger inn celler i den. Assembloid-enheten krever mye manuell håndtering, noe som øker risikoen for infeksjoner. For å minimere risikoen for infeksjoner, arbeid i en steril biosikkerhetshette med laminær luftstrøm, bytt hansker ofte og dekontaminer hanskene og arbeidsplassen med 80% etanol. Av lignende grunner må du ikke bruke de 3D-printede klemmeholderne mer enn én gang. Før selve innebyggingsprosessen er det viktig å holde alle hydrogelkomponentene (tverrbindingsløsning, kollagen-1-løsning) på is for å forhindre for tidlig tverrbinding. Følgelig må man jobbe raskt når cellene er tilsatt til tverrbindingsløsningen for å begrense celledød på grunn av den høye pH og lave temperaturen i tverrbindingsløsningen. For å forhindre tørkerelatert celledød i kjerneeksplantasjonen, aspirer mediet som dekker de klemte kjerneeksplantene umiddelbart før du blander tverrbindingsløsningen med kollagen-1-løsningen. For å garantere den sentrale plasseringen av kjerneeksplanten i hydrogelen, er det ideelt å kaste hydrogelen rundt en klemt kjerneeksplant som er litt spennet. For å gjøre dette, bruk pluggstiften og M3 x 16 mm boltskruen for å feste klemmeholderne til et (3D-trykt) platesett med hull i passende lengder. Etter polymerisasjonstiden på 50 minutter kan den innebygde kjerneeksplanten spennes igjen avhengig av de ønskede kulturforholdene. Mengden spenning assembloiden opplever under kultur har en dyp innvirkning på eksperimentelle utfall og skal holdes jevn på tvers av prøver og forhold21.

Ikke desto mindre er den store effekten av mekanisk (ikke-)belastning på eksperimentelle utfall en hovedfordel med assembloidmodellen fremfor de fleste vevskonstruerte alternativer, spesielt siden den vedlikeholdte matrisesammensetningen til kjerneeksplanten også bør gjenskape de komplekse in vivo-lastemønstrene på cellenivå90. Mens det i praksis bare er vist måling av den lineære elastiske modulen, maksimal strekkbelastning og maksimal strekkfasthet for assembloider så langt, er protokoller for utmattingsstyrke og spenningsavslappingsmålinger beskrevet for senekjerneeksplanter andre steder og bør gjelde for assembloidene91,92. I tillegg til in vivo-lignende lastemønstre, er assembloidens modularitet på flere nivåer sannsynligvis den største fordelen. Takket være de individuelle kulturkamrene kan et kontrollerbart sett med nisjeforhold stilles inn for hver prøve separat (dvs. temperatur, oksygenspenning, glukosekonsentrasjon, tilskudd, stimulatorer, hemmere og statisk strekk med en plate). Deretter kan matriksstivhet og matrikssammensetning av det ytre rommet tilpasses gjennom hydrogelsammensetningen og vil for eksempel tillate å studere virkningen av et stadig sykere vevsmikromiljø ved å inkorporere mer kollagen-3 og cellulært fibronektin 93,94,95. De vurderte cellepopulasjonene i det ytre rommet kan enkelt tilpasses ved å velge hvilke celler som skal frøes, men kan også modifiseres i senekjerneeksplanten ved å utnytte etablerte genetisk modifiserte cellelinjer og muselinjer (dvs. ScxLin-celleuttømming)96. Den forskjellige matrisen og cellesammensetningen til de to rommene gir videre en unik oppdelt 3D-struktur som er et annet sentralt senekjennetegn 1,30,46.

Når du bruker dette systemet, er det viktig å vurdere konsekvensene av systemets modularitet for granulariteten til utfallsparametrene. Mens celleproliferasjon og rekruttering kan vurderes for hvert rom separat, er de mekaniske egenskapene, sekretomkomponentene og nedbrytningsproduktene for tiden bare målbare for hele assembloiden. Når det gjelder gjennomstrømning, kan en riktig trent person forberede opptil 50 assembloider på en vanlig arbeidsdag, med den viktigste flaskehalsen som klemmeprosedyren. Mens noen av avlesningsmetodene utelukker hverandre, er det mulig å vurdere mekaniske egenskaper og sekretomkomponenter gjentatte ganger på samme prøve, samt enten cellepopulasjonssammensetning (flowcytometri), celletranskriptom (RT-qPCR, RNA-sekvensering) eller matrise og cellefordeling (immuncytokjemi/fluorescensmikroskopi) ved endepunkter. I tidligere publikasjoner har disse metodene blitt brukt til omfattende karakterisering av intercellulære, tverrkompartmentale interaksjoner i kjerne // fibroblast og kjerne // makrofagassembloider utsatt for en lesjonslignende nisje84,85. I dette arbeidet har evnen til assembloidmodellsystemet til å undersøke det tverrkompartmentale samspillet mellom kjernen og ekstrinsiske endotelceller under forskjellige mikromiljøstimuli blitt utforsket.

Modulariteten til modellsystemet muliggjør fremtidig forfining av metoden, noe som er nødvendig for å overvinne følgende begrensninger i den nåværende designiterasjonen. Den flowcytometriske analysen som ble presentert i dette arbeidet og encellede RNA-sekvenseringsdata publisert nylig avslørte at senkjerneresidente tenocytter og akillesseneavledede populasjoner er mer heterogene enn tidligere antatt: 24,34,59,84,97. I tillegg uskarper den migrerende oppførselen til opprinnelig kjerne- eller hydrogel-residente cellepopulasjoner assembloid compartmentalization under kultur. Begge faktorene sammen gjør det utfordrende å tilskrive transkriptomiske forskjeller til spesifikke celletyper og å skille spredning fra migrasjonsbaserte prosesser. Denne begrensningen kan overvinnes ved å raffinere inngangspopulasjonen med fluorescensaktivert cellesortering (FACS) basert på den cellulære sammensetningen av friske eller syke sener karakterisert i nyere in vivo-studier, forbedre avlesningen ved å implementere enkeltcelle RNA-sekvensering og integrere proliferasjonsmarkører som en EdU (5-etynyl-2'-deoksyuridin) farging under mikroskopi.

Assembloidene som presenteres her deler også en svakhet med de fleste av de tilgjengelige in vitro-systemene som simulerer syke organer koblet fra resten av kroppen98,99. Imidlertid posisjonerer den kulturkammerbaserte plattformen som brukes her, modellsystemet godt for integrering i en multiorganplattform hvor assembloider som etterligner forskjellige organer er koblet sammen og interorganinteraksjoner kan studeres.

I kjernen er modellsystemet basert på posisjonelle gnagersener, noe som resulterer i sitt eget unike sett med ulemper. For det første hemmes oversettbarheten av resultatene av villtypemus som ikke utvikler seg eller lider av senesykdommer 8,100,101. Integrering av vev og celler fra mennesker eller nyutviklede musestammer som viser aspekter av senesykdom, kan lindre dette problemet102. Byttet mot en menneskebasert assembloid er spesielt interessant, da det vil muliggjøre studier med pasientavledede vev fra forskjellige syke sener (dvs. tendinitt, tendinose eller peritendinitt) og til og med behandlingsresistente givere som kan låse opp mer personlige behandlingsprogrammer. For det andre håndterer ikke murine haleseneplanter overbelastningsindusert mikroskade spesielt godt, noe som begrenser anvendeligheten av modellsystemet for studier av akutt seneskade.

Av alle disse grunnene er explant // hydrogel assembloider i en førsteklasses posisjon for å studere senkjernebiologi, matrisestruktur-funksjonsinteraksjoner og tverrkompartmentale interaksjoner mellom spesifikke cellepopulasjoner som svar på nisjeindusert mikroskade. Innsikt samlet fra disse ganske høy gjennomstrømningsstudiene kan gi retning til in vivo forskning og behandlingsutvikling.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av ETH Grant 1-005733

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27) Sterican 9186174
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament Prusa NA
4% formaldehyde Roti-Histofix P087.4
Accutase cell detachment solution Sigma-Aldrich A6964-100ML
Amphotericin VWR L0009-100
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2 Motic NA
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel RS PRO 1871235
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel RS PRO 1871207
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
CD146 antibody: PE anti-mouse BioLegend 134703
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse BioLegend 141709
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse BioLegend 102413
CD86 antibody: PE anti-mouse BioLegend 105007
Collagenase I Thermo Fisher Scientific 17100017
Collagenase IV  Gibco 17104-019
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392-100ML
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 7000183
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G
DMEM/F12  Sigma 7002211
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel Accu HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone KauPO 09301-004-000001
Endopan 3 Kit Pan-Biotech P04-0010K
Endothelial cell growth supplement  Lonza CC-3162
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL) Eppendorf 30121023
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO Sigma-Aldrich 46043-1MG-F
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse BioLegend 123151
Falcon plastic tube (15 mL) Corning 352096
Falcon plastic tube (50 mL) Corning 352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa BD Bioscience 23-11617-02
Gelatin Invitrogen D12054
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate Sigma Z805939-1EA
Heparin Sigma-Aldrich H3149-10KU
Hydroxyproline assay Sigma-Aldrich MAK008
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML Motic NA
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate Wako Chemicals 013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker Corning 6780-FP
MEM non-essential amino acids Sigma 7002231
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF) PeproTech 315-02-50ug
MSD assay Mesoscale Discovery various
NucBlue Thermo Fisher Scientific R37605
Nylon mesh strainer cap, 100 µm Corning 734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer Prusa i3 MK3S
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L Gibco 10010001
Puromycin Gibco A1113803
RBC lysis buffer VWR 786-650
recombinant m-CSF  PeproTech 315-02
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro Qiagen 74034
Slicing software: PrusaSlicer Prusa NA Version 2.6.0 or higher
Sterile Cell Strainer 100 µm Fisherbrand 22363549
Surgical scalpel blade No. 21 Swann-Morton 307
Trizol reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Trypsin-EDTA (0.5 %) Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomaterialia. 63, 18-36 (2017).
  2. Wang, J. H. C. Mechanobiology of tendon. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1563-1582 (2006).
  3. Kirkendall, D. T., Garrett, W. E. Function and biomechanics of tendons. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 7 (2), 62-66 (1997).
  4. Götmark, F., Cafaro, P., O'Sullivan, J. Aging human populations: Good for us, good for the earth. Trends in Ecology and Evolution. 33 (11), 851-862 (2018).
  5. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinics in Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
  6. Renström, P. A. F. H., Woo, S. L. -Y. Tendinopathy: A major medical problem in sport. Tendinopathy in Athletes. , (2007).
  7. Screen, H. R. C., Birk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. Tendon functional extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 793-799 (2016).
  8. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G., Wunderli, S. L., Blache, U., Tendon, J. G. S. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  9. Magnusson, S. P., Langberg, H., Kjaer, M. The pathogenesis of tendinopathy: balancing the response to loading. Nature Reviews Rheumatology. 6 (5), 262-268 (2010).
  10. Heinemeier, K. M., Schjerling, P., Øhlenschlæger, T. F., Eismark, C., Olsen, J., Kjær, M. Carbon-14 bomb pulse dating shows that tendinopathy is preceded by years of abnormally high collagen turnover. FASEB Journal. 32 (9), 4763-4775 (2018).
  11. Andersson, G., Backman, L. J., Scott, A., Lorentzon, R., Forsgren, S., Danielson, P. Substance P accelerates hypercellularity and angiogenesis in tendon tissue and enhances paratendinitis in response to Achilles tendon overuse in a tendinopathy model. British Journal of Sports Medicine. 45 (13), 1017-1022 (2011).
  12. Rolf, C. G., Fu, B. S. C., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRβ causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology. 40 (3), 256-261 (2001).
  13. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
  14. Jarvinen, M., Jozsa, L., Kannus, P., Järvinen, T. L., Kvist, M., Leadbetter, W. Histopathological findings in chronic tendon disorders. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 7 (2), 86-95 (1997).
  15. Soslowsky, L. J., et al. Overuse activity injures the supraspinatus tendon in an animal model: A histologic and biomechanical study. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 9 (2), 79-84 (2000).
  16. Tran, P. H. T., et al. Early development of tendinopathy in humans: Sequence of pathological changes in structure and tissue turnover signaling. FASEB Journal. 34 (1), 776-788 (2020).
  17. Theodossiou, S. K., Schiele, N. R. Models of tendon development and injury. BMC Biomedical Engineering. 1 (1), 1-24 (2019).
  18. Stauber, T., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon tissue microdamage and the limits of intrinsic repair. Matrix Biology. 85-86, 68-79 (2020).
  19. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  20. Fang, F., Sawhney, A. S., Lake, S. P. Different regions of bovine deep digital flexor tendon exhibit distinct elastic, but not viscous, mechanical properties under both compression and shear loading. Journal of Biomechanics. 47 (12), 2869-2877 (2014).
  21. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biology. 89, 11-26 (2020).
  22. Wunderli, S. L., et al. Minimal mechanical load and tissue culture conditions preserve native cell phenotype and morphology in tendon - A novel ex vivo mouse explant model. Journal of Orthopaedic Research. 36 (5), 1383-1390 (2017).
  23. Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Egerbacher, M., Caballero, O., Gardner, K. Matrix metalloproteinase inhibitors prevent a decrease in the mechanical properties of stress-deprived tendons. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 763-769 (2007).
  24. de Micheli, A. J., et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies extensive heterogeneity in the cellular composition of mouse Achilles tendons. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 319 (5), C885-C894 (2020).
  25. Arvind, V., Huang, A. H. Reparative and maladaptive inflammation in tendon healing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9 (July), 1-16 (2021).
  26. Marsolais, D., Côté, C. H., Frenette, J. Neutrophils and macrophages accumulate sequentially following Achilles tendon injury. Journal of Orthopaedic Research. 19 (6), 1203-1209 (2001).
  27. Garcia-Melchor, E., et al. Novel self-amplificatory loop between T cells and tenocytes as a driver of chronicity in tendon disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (8), 1075-1085 (2021).
  28. Stolk, M., Klatte-Schulz, F., Schmock, A., Minkwitz, S., Wildemann, B., Seifert, M. New insights into tenocyte-immune cell interplay in an in vitro model of inflammation. Scientific Reports. 7 (1), 9801 (2017).
  29. Tempfer, H., Traweger, A. Tendon vasculature in health and disease. Frontiers in Physiology. 6, 330 (2015).
  30. Mienaltowski, M. J., Adams, S. M., Birk, D. E. Regional differences in stem cell/progenitor cell populations from the mouse achilles tendon. Tissue Engineering - Part A. 19 (1-2), 199-210 (2013).
  31. Sakabe, T., et al. Transcription factor scleraxis vitally contributes to progenitor lineage direction in wound healing of adult tendon in mice. Journal of Biological Chemistry. 293, (2018).
  32. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Matthews, B. G., Li, Y., Kalajzic, I., Rowe, D. W. Lineage tracing of resident tendon progenitor cells during growth and natural healing. PLoS One. 9 (4), e96113 (2014).
  33. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3 + Pdgfra + tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  34. Zhang, J., et al. Characterization of the structure, vascularity, and stem/progenitor cell populations in porcine Achilles tendon (PAT). Cell and Tissue Research. 384 (2), 367-387 (2021).
  35. Tarafder, S., et al. Tendon stem/progenitor cells regulate inflammation in tendon healing via JNK and STAT3 signaling. FASEB Journal. 31 (9), 3991-3998 (2017).
  36. Lee, C. H., et al. Harnessing endogenous stem/progenitor cells for tendon regeneration Find the latest version Harnessing endogenous stem/progenitor cells for tendon regeneration. J Clin Invest. 125 (7), 2690-2701 (2015).
  37. Lui, P. P. Y., Chan, L. S., Cheuk, Y. C., Lee, Y. W., Chan, K. M. Expression of bone morphogenetic protein-2 in the chondrogenic and ossifying sites of calcific tendinopathy and traumatic tendon injury rat models. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 4, 27 (2009).
  38. Takeuchi, E., et al. Localization and expression of osteopontin in the rotator cuff tendons in patients with calcifying tendinitis. Virchows Archiv. 438 (6), 612-617 (2001).
  39. Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
  40. Millar, N. L., et al. MicroRNA29a regulates IL-33-mediated tissue remodelling in tendon disease. Nature Communications. 6, 6774 (2015).
  41. Riley, G. P., Harrall, R. L., Constant, C. R., Chard, M. D., Cawston, T. E., Hazleman, B. L. Tendon degeneration and chronic shoulder pain: changes in the collagen composition of the human rotator cuff tendons in rotator cuff tendinitis. Annals of the Rheumatic Diseases. 53 (6), 359-366 (1994).
  42. Thorpe, C. T., Peffers, M. J., Simpson, D., Halliwell, E., Screen, H. R. C., Clegg, P. D. Anatomical heterogeneity of tendon: Fascicular and interfascicular tendon compartments have distinct proteomic composition. Scientific Reports. 6, 20455 (2016).
  43. Thorpe, C. T., et al. Distribution of proteins within different compartments of tendon varies according to tendon type. Journal of Anatomy. 229 (3), 450-458 (2016).
  44. Choi, H., et al. Heterogeneity of proteome dynamics between connective tissue phases of adult Tendon. eLife. 9, e55262 (2020).
  45. Spiesz, E. M., et al. Tendon extracellular matrix damage, degradation and inflammation in response to in vitro overload exercise. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 889-897 (2015).
  46. Dyment, N. A., et al. The paratenon contributes to scleraxis-expressing cells during patellar tendon healing. PLoS One. 8 (3), e59944 (2013).
  47. Cadby, J. A., Buehler, E., Godbout, C., Van Weeren, P. R., Snedeker, J. G. Differences between the cell populations from the peritenon and the tendon core with regard to their potential implication in tendon repair. PLoS One. 9 (3), e92474 (2014).
  48. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From three-dimensional cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
  49. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266 (2017).
  50. Wang, J. H. C. Mechanobiology of tendon. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1563-1582 (2006).
  51. Derwin, K. A., Soslowsky, L. J. A quantitative investigation of structure-function relationships in a tendon fascicle model. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (6), 598-604 (1999).
  52. Herod, T. W., Veres, S. P. Development of overuse tendinopathy: A new descriptive model for the initiation of tendon damage during cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 467-476 (2017).
  53. Andersen, M. B., Pingel, J., Kjær, M., Langberg, H. Interleukin-6: A growth factor stimulating collagen synthesis in human tendon. Journal of Applied Physiology. 110 (6), 1549-1554 (2011).
  54. Langberg, H., Rosendal, L., Kjær, M. Training-induced changes in peritendinous type I collagen turnover determined by microdialysis in humans. Journal of Physiology. 534 (1), 297-302 (2001).
  55. Zitnay, J. L., et al. Molecular level detection and localization of mechanical damage in collagen enabled by collagen hybridizing peptides. Nature Communications. 8, 14913 (2017).
  56. Hwang, J., et al. Molecular assessment of collagen denaturation in decellularized tissues using a collagen hybridizing peptide. Acta Biomaterialia. 53, 268-278 (2016).
  57. Lin, A. H., Zitnay, J. L., Li, Y., Yu, S. M., Weiss, J. A. Microplate assay for denatured collagen using collagen hybridizing peptides. Journal of Orthopaedic Research. 37 (2), 431-438 (2019).
  58. Blomgran, P., Blomgran, R., Ernerudh, J., Aspenberg, P. A possible link between loading, inflammation and healing: Immune cell populations during tendon healing in the rat. Scientific Reports. 6, 29824 (2016).
  59. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. -M. A Tppp3+Pdgfra+ tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  60. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  61. Godinho, M. S. C., Thorpe, C. T., Greenwald, S. E., Screen, H. R. C. Elastin is localised to the interfascicular matrix of energy storing tendons and becomes increasingly disorganised with ageing. Scientific Reports. 7 (1), 9713 (2017).
  62. Smith, M. M., et al. Modulation of aggrecan and ADAMTS expression in ovine tendinopathy induced by altered strain. Arthritis and Rheumatism. 58 (4), 1055-1066 (2008).
  63. Asundi, K. R., Rempel, D. M. MMP-1, IL-1β, and COX-2 mRNA expression is modulated by static load in rabbit flexor tendons. Annals of Biomedical Engineering. 36 (2), 237-243 (2008).
  64. Millar, N. L., et al. Inflammation is present in early human tendinopathy. American Journal of Sports Medicine. 38 (10), 2085-2091 (2010).
  65. Dakin, S. G., et al. Inflammation activation and resolution in human tendon disease. Science Translational Medicine. 7 (311), 311ra173 (2015).
  66. Jelinsky, S. A., Rodeo, S. A., Li, J., Gulotta, L. V., Archambault, J. M., Seeherman, H. J. Regulation of gene expression in human tendinopathy. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 86 (2011).
  67. Kannus, P., Józsa, L. Histopathological changes preceding spontaneous rupture of a tendon. A controlled study of 891 patients. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 73 (10), 1507-1525 (1991).
  68. Comin, J., et al. The prevalence and clinical significance of sonographic tendon abnormalities in asymptomatic ballet dancers: A 24-month longitudinal study. British Journal of Sports Medicine. 47 (2), 89-92 (2013).
  69. Schubert, T. E. O., Weidler, C., Lerch, K., Hofstädter, F., Straub, R. H. Achilles tendinosis is associated with sprouting of substance P positive nerve fibres. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (7), 1083-1086 (2005).
  70. Quigley, A. S., Bancelin, S., Deska-Gauthier, D., Légaré, F., Kreplak, L., Veres, S. P. In tendons, differing physiological requirements lead to functionally distinct nanostructures. Scientific Reports. 8 (1), 4409 (2018).
  71. Herod, T. W., Chambers, N. C., Veres, S. P. Collagen fibrils in functionally distinct tendons have differing structural responses to tendon rupture and fatigue loading. Acta Biomaterialia. 42, 296-307 (2016).
  72. Shepherd, J. H., Riley, G. P., Screen, H. R. C. Early stage fatigue damage occurs in bovine tendon fascicles in the absence of changes in mechanics at either the gross or micro-structural level. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 38, 163-172 (2014).
  73. Birch, H. L. Tendon matrix composition and turnover in relation to functional requirements. International Journal of Experimental Pathology. 88 (4), 241-248 (2007).
  74. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  75. Hussien, A. A., Niederoest, B., Bollhalder, M., Goedecke, N., Snedeker, J. G. The stiffness-sensitive transcriptome of human tendon stromal cells. Advanced Healthcare Materials. 12 (7), 2101216 (2023).
  76. Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nature Biomedical Engineering. 7 (2), 177-191 (2023).
  77. Liu, C. -F., Aschbacher-Smith, L., Barthelery, N. J., Dyment, N., Butler, D., Wylie, C. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: A developmental biology perspective. Tissue Engineering Part B: Reviews. 17 (3), 165-176 (2011).
  78. Ruiz-Alonso, S., Lafuente-Merchan, M., Ciriza, J., Saenz-del-Burgo, L., Pedraz, J. L. Tendon tissue engineering: Cells, growth factors, scaffolds and production techniques. Journal of Controlled Release. 333, 448-486 (2021).
  79. Rinoldi, C., et al. Tendon tissue engineering: Effects of mechanical and biochemical stimulation on stem cell alignment on cell-laden hydrogel yarns. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), e1801218 (2019).
  80. Walia, B., Huang, A. H. Tendon stem progenitor cells: Understanding the biology to inform therapeutic strategies for tendon repair. Journal of Orthopaedic Research. 37 (6), 1270-1280 (2018).
  81. Thorpe, C. T., Riley, G. P., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. Fascicles from energy-storing tendons show an age-specific response to cyclic fatigue loading. Journal of The Royal Society Interface. 11 (92), 20131058-20131058 (2014).
  82. Thorpe, C. T., Riley, G. P., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. Fascicles and the interfascicular matrix show decreased fatigue life with ageing in energy storing tendons. Acta Biomaterialia. 56, 58-64 (2017).
  83. Youngstrom, D. W., Rajpar, I., Kaplan, D. L., Barrett, J. G. A bioreactor system for in vitro tendon differentiation and tendon tissue engineering. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 911-918 (2015).
  84. Stauber, T., et al. Extrinsic macrophages protect while tendon progenitors degrade: Insights from a tissue engineered model of tendon compartmental crosstalk. Advanced Healthcare Materials. 10 (20), e2100741 (2021).
  85. Stauber, T., Moschini, G., Hussien, A. A., Jaeger, P. K., De Bock, K., Snedeker, J. G. IL-6 signaling exacerbates hallmarks of chronic tendon disease by stimulating progenitor proliferation & migration to damage. eLife. 12, RP87092 (2023).
  86. Doillon, C. J., Mantovani, D., Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. Preparation of ready-to-use storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1 (6), 2753-2758 (2007).
  87. Blache, U., et al. Inhibition of ERK 1/2 kinases prevents tendon matrix breakdown. Scientific Reports. 11 (1), 6838 (2021).
  88. Liu, X., et al. The role of vascular endothelial growth factor in tendon healing. Frontiers in Physiology. 12, 766080 (2021).
  89. Claxton, S., Kostourou, V., Jadeja, S., Chambon, P., Hodivala-dilke, K., Fruttiger, M. Efficient, inducible Cre-recombinase activation in vascular endothelium. Genesis. 46 (2), 74-80 (2008).
  90. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nature Biomedical Engineering. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  91. Lee, A. H., Szczesny, S. E., Santare, M. H., Elliott, D. M. Investigating mechanisms of tendon damage by measuring multi-scale recovery following tensile loading. Acta Biomaterialia. 57, 363-372 (2017).
  92. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-scale loading and damage mechanisms of plantaris and rat tail tendons. Journal of Orthopaedic Research. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  93. Williams, I. F., Heaton, A., McCullagh, K. G. Cell morphology and collagen types in equine tendon scar. Research in Veterinary Science. 28 (3), 302-310 (1980).
  94. Maffulli, N., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Reaper, J., Barrass, V. Tenocytes from ruptured and tendinopathic achilles tendons produce greater quantities of type III collagen than tenocytes from normal achilles tendons: An in vitro model of human tendon healing. American Journal of Sports Medicine. 28 (4), 499-505 (2000).
  95. Pajala, A., Melkko, J., Leppilahti, J., Ohtonen, P., Soini, Y., Risteli, J. Tenascin-C and type I and III collagen expression in total Achilles tendon rupture. An immunohistochemical study. Histology and Histopathology. 24 (10), 1207-1211 (2009).
  96. Best, K. T., et al. Scleraxis-lineage cell depletion improves tendon healing and disrupts adult tendon homeostasis. eLife. 10, e62203 (2021).
  97. Lehner, C., et al. Tenophages: A novel macrophage-like tendon cell population expressing CX3CL1 and CX3CR1. DMM Disease Models and Mechanisms. 12 (12), dmm041384 (2019).
  98. Ajalik, R. E., et al. Human organ-on-a-chip microphysiological systems to model musculoskeletal pathologies and accelerate therapeutic discovery. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 846230 (2022).
  99. Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
  100. Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. The Journal of Infectious Diseases. 208 Suppl (Suppl 2), 125-130 (2013).
  101. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Disease Models & Mechanisms. 7 (11), 1205-1213 (2014).
  102. Costa-Almeida, R., Calejo, I., Reis, R. L., Gomes, M. E. Crosstalk between adipose stem cells and tendon cells reveals a temporal regulation of tenogenesis by matrix deposition and remodeling. Journal of Cellular Physiology. 233 (7), 5383-5395 (2018).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 205
Engineering Tendon Assembloids å sonde Cellular Crosstalk i sykdom og reparasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stauber, T., Wolleb, M., Snedeker,… More

Stauber, T., Wolleb, M., Snedeker, J. G. Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair. J. Vis. Exp. (205), e65987, doi:10.3791/65987 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter