Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziell entwickelten Aufzeichnungsgeräts und von Elektroden zur Aufzeichnung lokaler Feldpotentiale und zur Untersuchung des Informationsflusses im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex.
Abstract
Die Technik der Aufzeichnung von lokalen Feldpotentialen (LFPs) ist eine elektrophysiologische Methode, mit der die elektrische Aktivität lokalisierter neuronaler Populationen gemessen wird. Es dient als wichtiges Werkzeug in der Kognitionsforschung, insbesondere in Gehirnregionen wie dem Hippocampus und dem präfrontalen Kortex. Duale LFP-Aufnahmen zwischen diesen Bereichen sind von besonderem Interesse, da sie die Erforschung der interregionalen Signalkommunikation ermöglichen. Die Methoden zur Durchführung dieser Aufnahmen werden jedoch selten beschrieben, und die meisten kommerziellen Aufnahmegeräte sind entweder teuer oder nicht anpassungsfähig, um spezifische experimentelle Designs aufzunehmen. Diese Studie stellt ein umfassendes Protokoll für die Durchführung von Doppelelektroden-LFP-Aufzeichnungen im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex vor, um die Auswirkungen von Antipsychotika und Kaliumkanalmodulatoren auf die LFP-Eigenschaften in diesen Bereichen zu untersuchen. Die Technik ermöglicht die Messung von LFP-Eigenschaften, einschließlich Leistungsspektren innerhalb jeder Gehirnregion und der Kohärenz zwischen den beiden. Zusätzlich wurde für diese Experimente ein kostengünstiges, speziell angefertigtes Aufzeichnungsgerät entwickelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Möglichkeit bietet, Signale mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen in verschiedenen Hirnregionen aufzuzeichnen, was die Untersuchung der interregionalen Informationskommunikation innerhalb des Gehirns erleichtert.
Introduction
Lokale Feldpotentiale (LFPs) beziehen sich auf die elektrische Aktivität, die aus dem extrazellulären Raum aufgezeichnet wird und die kollektive Aktivität einer lokalisierten Gruppe von Neuronen widerspiegelt. Sie weisen einen vielfältigen Frequenzbereich auf, der von langsamen Wellen bei 1 Hz bis hin zu schnellen Schwingungen bei 100 Hz oder 200 Hz reicht. Spezifische Frequenzbänder wurden mit kognitiven Funktionen wie Lernen, Gedächtnisund Entscheidungsfindung in Verbindung gebracht 1,2. Veränderungen der LFP-Eigenschaften wurden als Biomarker für verschiedene neurologische Erkrankungen, einschließlich Demenz und Schizophrenie, verwendet 3,4. Die Analyse von LFP-Aufzeichnungen kann wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Erkrankungen und mögliche therapeutische Strategien bieten.
Die Dual-LFP-Aufzeichnung ist eine Technik, mit der die lokalisierte elektrische Aktivität innerhalb und zwischen zwei bestimmten Gehirnregionen gemessen wird. Diese Technik bietet eine wertvolle Gelegenheit, die komplizierte neuronale Dynamik und Signalkommunikation zu untersuchen, die innerhalb und zwischen verschiedenen Gehirnregionen abläuft. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Erkennung von Veränderungen in den neuronalen Eigenschaften einzelner Hirnregionen komplex sein kann, aber Veränderungen in der interregionalen kortikalen Kommunikation können beobachtet werden 5,6. Daher bietet die Verwendung von Dual-LFP-Aufnahmen ein wirksames Mittel, um dieses Problem zu lösen.
Die hippokampal-präfrontale Konnektivität spielt eine entscheidende Rolle bei der Modulation der kognitiven Funktionen, und Dysfunktionen wurden mit verschiedenen neurologischen Störungen in Verbindung gebracht 7,8. Dual-Elektroden-Aufzeichnungen dieser Regionen können Aufschluss über diese Wechselwirkungen geben. Leider gibt es nur begrenzte Informationen über Methoden zur Durchführung von Doppelelektroden-LFP-Aufnahmen zwischen diesen Bereichen. Darüber hinaus sind kommerziell erhältliche Aufzeichnungsgeräte in der Regel teuer und nicht an spezifische Versuchsdesigns anpassbar. Bei der herkömmlichen Methode zur Aufzeichnung von LFPs wird das Aufzeichnungsgerät mit einem abgeschirmten Kabel an Elektroden angeschlossen, die in das Gehirn eines Tieres implantiert werden. Dieser Ansatz ist jedoch anfällig für Bewegungsartefakte und Umgebungsgeräusche, die sich auf die Qualität und Zuverlässigkeit der aufgezeichneten Signale auswirken.
Dieses Protokoll beschreibt ein umfassendes Verfahren zur Durchführung von LFP-Aufzeichnungen mit zwei Elektroden im Hippocampus und im präfrontalen Kortex der Maus unter Verwendung eines kostengünstigen, speziell entwickelten Kopftisches, der auf dem Kopf des Tieres platziert werden kann. Diese Methoden ermöglichen es den Forschern, regionsspezifische oszillatorische Muster innerhalb zweier diskreter Hirnregionen zu untersuchen und den interregionalen Informationsaustausch und die Konnektivität zwischen diesen Bereichen zu untersuchen.
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Protocol
Diese Studie wurde von der Florey Animal Ethics Commission (The University of Melbourne, Nr. 22-025UM) in Übereinstimmung mit dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden C57BL/6 männliche Mäuse (8 Wochen) verwendet, die vom Animal Resources Centre (Australien) gewonnen wurden.
1. Design und Herstellung von Headstage
HINWEIS: Die Headstage-Leiterplatte ist eine kompakte 14 mm x 12 mm große vierlagige Platine, die direkt auf den Kopf des Tieres aufgesetzt werden kann. Es verwendet einen kommerziellen Verstärkerchip (siehe Materialtabelle), und alle Design- und Gerber-Dateien sind online verfügbar (GitHub-Link: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Geben Sie dem Hersteller die folgenden Spezifikationen an: Dicke der Platte: 0,6 mm; Minimaler Tracking/Abstand: 4 mils; Minimale Lochgröße: 0,2 mm.
- Befolgen Sie während des Leiterplattenbestückungsprozesses diese Reihenfolge:
- Löten Sie den Verstärkerchip mit einer Heißluftpistole auf die Platine, die auf 350 °C eingestellt ist.
- Löten Sie die passiven Komponenten.
- Löten Sie den SPI-Stecker und den Elektrodenstecker (siehe Materialtabelle).
- Prüfen Sie das Löten zur Qualitätssicherung unter dem Mikroskop. Befestigen Sie den SPI-Stecker mit Epoxidharz für zusätzliche Stabilität.
- Verwenden Sie für die Signalerfassung Aufzeichnungssoftware von Drittanbietern und eine Steuerplatine (siehe Materialtabelle). Detaillierte Anweisungen finden Sie im Benutzerhandbuch der Software.
- Die entworfene Kopfbühne unterstützt 8 Kanäle. Aktivieren Sie in der Software die Kanäle 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 und 23 für die Aufnahme.
2. Herstellung von Elektroden
- Schneiden Sie PFA-beschichtete Wolframdrähte (siehe Materialtabelle) auf bestimmte Längen für verschiedene Elektrodentypen zu: präfrontale Kortexelektrode (12 mm), Hippocampus-Elektrode (10 mm) und Masseelektrode (6 mm).
- Schneiden Sie das Messingrohr (siehe Werkstofftabelle) in 3 mm große Segmente.
- Entfernen Sie 2 mm der Beschichtung am Ende jedes Drahtes mit einem Feuerzeug und löten Sie dann den Elektrodendraht sicher mit dem Messingrohr zusammen. Das Messingrohr hat einen Innendurchmesser von 0,45 mm und einen Außendurchmesser von 0,60 mm.
- Für die Masseelektrode löten Sie eine Schraube aus Edelstahl M1.2 (siehe Werkstofftabelle) an die Elektrode. Tragen Sie Flussmittel auf Phosphorsäurebasis auf die Schraube auf, um das Löten zu verbessern. Reinigen Sie die Schraube nach dem Löten mit Alkohol.
HINWEIS: Tragen Sie zum Schutz während des Lötvorgangs Handschuhe.
3. Chirurgischer Eingriff
- Betäuben Sie die Maus in einer Anästhesiekammer mit 3% Isofluran und 1 L/min Sauerstofffluss.
- Legen Sie die betäubte Maus auf ein Heizkissen und befestigen Sie sie in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle).
- Passen Sie die Erhaltungsrate von Isofluran auf 2,5-3% an und reduzieren Sie den Sauerstofffluss auf 500 mL/min. Überprüfen Sie anhand der Zehenklemme, ob das Tier noch unter tiefer Narkose steht.
- Injizieren Sie subkutan Carprofen in einer Menge von 0,5 mg/kg und tragen Sie Augensalbe zum Augenschutz auf.
- Rasieren und sterilisieren Sie den Kopf der Maus mit Povidon-Jod und 80% Ethanol.
- Machen Sie einen 8-mm-Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut und entfernen Sie das Bindegewebe im Schnittbereich.
- Tragen Sie Wasserstoffperoxid auf, um die Oberfläche des Schädels zu reinigen, und achten Sie darauf, die umgebende Haut nicht zu berühren.
- Richten Sie die Bregma- und Lambda-Orientierungspunkte auf die gleiche Höhe aus, um eine genaue Elektrodenplatzierung zu gewährleisten (Bregma und Lambda sind dort, wo die sagittale Naht die koronale und die lambdoide Naht schneidet).
- Bohren Sie Löcher für Referenz-/Masseelektrode, Ankerschrauben (0,9 mm Bohrgrat) und aktive Elektroden (0,3 mm Bohrgrat) an vorgegebenen Koordinaten.
- Befestigen Sie die maßgefertigte Elektrode (Schritt 2) am stereotaktischen Rahmenarm und stellen Sie sicher, dass sie senkrecht zum Gehirn steht.
- Implantieren Sie die Elektrode in den hippokampalen CA1-Bereich (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
HINWEIS: AP, anteroposterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventral. - Wiederholen Sie die Elektrodenimplantation in den präfrontalen Kortex (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
- Sichern Sie die Elektroden mit einem handelsüblichen leistungsstarken Klebstoff und Zahnzement (siehe Materialtabelle).
- Implantieren Sie zwei 1,2 mm Ankerschrauben (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm), um Bewegungen zu verhindern.
- Positionieren Sie die Referenz-/Masseelektrode in direktem Kontakt mit der Dura mater, 2 mm posterior und 2 mm einseitig zum Lambda-Landmarke.
- Verbinden Sie die Messingrohrseite der Elektroden mit einem mehrkanaligen Buchsenstecker (siehe Materialtabelle) mit der Masseelektrode in der Mitte.
- Verwenden Sie zur Isolierung einen 0,8-mm-Schrumpfschlauch an der Außenseite des mittleren Stifts.
- Befestigen Sie die Elektroden, Ankerschrauben und den Verbinder mit Klebstoff und Zahnzement.
4. Nachsorge
- Um postoperative Schmerzen zu lindern, injizieren Sie Carprofen in einer Dosis von 5-10 mg/kg subkutan alle 12-24 Stunden, basierend auf einer Beurteilung der Schmerzen über einen Zeitraum von drei Tagen.
- Geben Sie dem Tier eine einwöchige Erholungsphase, bevor Sie mit Aufzeichnungs- oder Versuchsverfahren beginnen.
5. Ablauf der Aufzeichnung
- Fassen Sie das Tier an drei aufeinanderfolgenden Tagen zweimal täglich 15 Minuten lang an.
- Heben Sie die Mäuse auf, indem Sie die Hand vorsichtig um sie schließen, ohne übermäßigen Druck auszuüben.
- Legen Sie das Kopfbrett an drei aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich für 30 Minuten auf den Kopf des Tieres.
- Gewöhnen Sie das Tier am Aufnahmetag für 30 Minuten an den Aufnahmeraum.
- Setzen Sie das Tier in eine kleine Aufzeichnungskammer in einem Faradayschen Käfig, um externe elektrische Störungen zu reduzieren. Schließen Sie die benutzerdefinierte Headstage für die Aufnahme an.
- Öffnen Sie die Aufnahmesoftware und wählen Sie eine Abtastrate von 2,00 kHz. Deaktivieren Sie alle Kanäle außer 13 und 20, indem Sie jeden Kanal auswählen und die Leertaste drücken.
- Legen Sie im Fenster Hardwarebandbreite die untere Bandbreite auf 2 Hz und die obere Bandbreite auf 100 Hz fest.
- Stellen Sie im Software-Filterfenster den Tiefpassfilter auf 100 Hz und den Hochpassfilter auf 2 Hz ein.
- Wählen Sie den Speicherpfad aus, indem Sie auf Dateiname auswählen klicken und dann auf Aufzeichnen klicken.
- Beginnen Sie jede Aufzeichnungssitzung mit einer 10-minütigen Gewöhnungsphase, gefolgt von einer 15-minütigen EEG-Aufzeichnung zu Studienbeginn.
- Verabreichen Sie das Medikament nach der Baseline-Aufzeichnung durch intraperitoneale Injektion und setzen Sie die Aufzeichnung ohne Verzögerung für weitere 30 Minuten fort.
HINWEIS: Im Abschnitt Ergebnisse finden Sie Einzelheiten zu den verwendeten Arzneimitteln.
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Representative Results
Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen die Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe auf die Eigenschaften lokaler Feldpotentiale (LFPs), die an vier Kohorten von männlichen C57BL/6-Mäusen getestet wurden (n = 8 für jede Kohorte; Alter: 8 Wochen; Gewicht: 24,0 ± 0,42 g). Zu den getesteten Medikamenten gehörten das Antipsychotikum Clozapin, die Kaliumkanalmodulatoren 4-Aminopyridin (4-AP) und Retigabin sowie die Kochsalzlösung des Kontrollvehikels.
Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde die Maus in eine kleine Aufnahmekammer gebracht und die LFPs aus dem Hippocampus (HIP) und dem präfrontalen Kortex (PFC) mit Hilfe eines speziell entwickelten Kopftisches gesammelt. Da sich diese Studie hauptsächlich auf die Untersuchung der Theta- und Gamma-Frequenzbänder konzentrierte, wurde das aufgezeichnete Signal zunächst einer anfänglichen Bandpassfilterung in einem Frequenzbereich von 2-100 Hz unterzogen, gefolgt von einer Abtastung bei 2000 Hz. Das Signal wurde dann in mehrere 2 s Epochen unterteilt. Epochen, die ausgeprägte Bewegungsartefakte aufwiesen, wurden identifiziert und anschließend von nachfolgenden Analyseprozessen ausgeschlossen. Die Leistungsspektren von LFPs sowohl in der HIP als auch in der PFC sowie die HIP-PFC-Kohärenz wurden mit einer Multi-Taper-basierten Analysemethodegemessen 9. Bei der Analyse wurden fünf Slepian-Taper verwendet, und die Zeit-Bandbreite wurde auf drei eingestellt, um die optimale spektrale Konzentration zu erreichen. Ein gleitendes Fenster von 1 s und eine Schrittweite von 100 ms wurden verwendet, um die Zeit-Frequenz-Spektrogramme und den Zeitverlauf der HIP-PFC-Kohärenz zu erzeugen.
Wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 gezeigt, hatte die Verabreichung von Kochsalzlösung keine erkennbaren Auswirkungen auf die Leistungsspektren von LFPs in HIP und PFC oder auf die HIP-PFC-Kohärenz. Sowohl Retigabin als auch Clozapin zeigten eine deutliche Verringerung der Gammaband-Leistung (30-100 Hz) bei HIP und PFC sowie der HIP-PFC-Kohärenz im Gammaband. Im Gegensatz dazu zeigte 4-AP die gegenteiligen Effekte, die durch eine erhöhte Gamma-Band-Leistung in HIP und PFC gekennzeichnet waren, zusammen mit einer erhöhten Kohärenz innerhalb der Gamma-Bande zwischen HIP und PFC.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Im Hippocampus (HIP) und im präfrontalen Kortex (PFC) wurden Elektroden implantiert, um lokale Feldpotentiale aufzuzeichnen. Das Tier wurde in eine kleine Aufnahmekammer gebracht, und an den Elektrodenanschluss wurde ein speziell angefertigter Kopftisch angeschlossen. Jede Aufnahmesitzung begann mit einer 10-minütigen Basissitzung, gefolgt von einer 30-minütigen Drogensitzung. Die Wirkungen von Kochsalzlösung, Clozapin, 4-AP und Retigabin wurden getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Einfluss von Antipsychotika und Kaliumkanalmodulatoren auf die anhaltende elektrophysiologische Aktivität im Hippocampus (HIP) und im präfrontalen Kortex (PFC). Das normierte Spektrogramm der lokalen Feldpotentiale in HIP und PFC sowie die HIP-PFC-Kohärenz zeigten für alle untersuchten Wirkstoffe zeitabhängige Effekte. Die Medikamente wurden per intraperitonealer Injektion zum Zeitpunkt t = 15 min verabreicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der Einfluss von Antipsychotika und Kaliumkanalmodulatoren auf die Leistungsspektrendichte in HIP und PFC. 4-AP erhöhte die Gamma-Band-Leistung in beiden Hirnregionen signifikant, während Clozapin und Retigabin die Gamma-Band-Leistung in beiden Regionen unterdrückten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Konstruktion eines maßgeschneiderten Kopftisches, der speziell für die gleichzeitige Aufzeichnung von dualen lokalen Feldpotentialen (LFPs) im Hippocampus (HIP) und im präfrontalen Kortex (PFC) entwickelt wurde. Die detaillierten Schritte in diesem Protokoll bieten den Forschern ausreichende Informationen, um die Signalkommunikation sowohl innerhalb jeder Region als auch zwischen HIP und PFC gründlich zu untersuchen.
Der speziell entwickelte Kopftisch verwendet einen kommerziellen Verstärkerchip. Während die aktuelle Konfiguration die Aufzeichnung von 8 Kanälen unterstützt, kann der Kopftisch leicht angepasst werden, um die volle Kapazität von 32 Kanälen aufzunehmen, wodurch das Potenzial für eine erweiterte Kanalkapazität geschaffen wird, die für die Aufzeichnung von Elektrodenarrays geeignet ist. In Anbetracht der geringen Kosten des Kopftisches besteht eine Möglichkeit darin, das Brett dauerhaft am Kopf des Tieres zu befestigen. Dieser Ansatz bietet den Vorteil, dass Bewegungsartefakte minimiert und das Gesamtniveau der durch Bewegung verursachten Störungen reduziert wird.
Die speziell angefertigte Elektrode demonstriert eine stabile Langzeitaufzeichnung von LFPs und behält eine gute Signalqualität über einen Zeitraum von 3-5 Monaten bei. Ein weiterer praktikabler Ansatz besteht darin, flexible Leiterplatten auf Polyimidbasis als Elektrodenarrayszu verwenden 10,11. Diese flexiblen Leiterplatten können in den Aufnahmekopf integriert werden, um eine Mehrkanalaufnahme zu ermöglichen. Diese Methode bietet den Vorteil, dass die Elektrodenvorbereitung und chirurgische Eingriffe vereinfacht werden. Das Gewicht des Implantats mit und ohne Kopftisch ist mit 0,198 g bzw. 0,812 g sehr gering und eignet sich daher für sehr junge Mäuse.
Eine Einschränkung der derzeitigen Aufzeichnungstechnik ist die potentielle Interferenz durch das hängende Kabel, die das natürliche Verhalten des Tieres während der Versuche beeinträchtigen kann. Um dieses Problem zu lösen, können alternative Lösungen in Betracht gezogen werden, wie z. B. die Verwendung einer SD-Karte zur Datenspeicherung oder die Implementierung eines drahtlosen Signalübertragungsmoduls.
Ein wesentlicher und kritischer Schritt des Protokolls ist die genaue Positionierung der Elektrode. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine präzise und konsistente Elektrodenplatzierung zu gewährleisten, um eine Vergleichbarkeit zwischen den Experimenten zu ermöglichen. Um die Position der Elektrode zu überprüfen, muss eine Histologie durchgeführt werden12. Eine nützliche Technik, um die richtige Elektrodenpositionierung im HPC zu verbessern, ist die Aufnahme, während die Elektrode vertikal eingeführt ist, da starke Theta-Rhythmen und neuronales Feuern die korrekte Platzierung anzeigen. Es ist ratsam, adulte Mäuse zu verwenden, die älter als 8 Wochen sind, da die Signalqualität mit der Zeit abnehmen oder zu einer falschen Platzierung führen kann, wenn die Mäuse älter werden. Die Berücksichtigung dieser Überlegungen trägt dazu bei, die Zuverlässigkeit und Gültigkeit der Versuchsergebnisse zu erhalten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll einen Rahmen für die Untersuchung der Signalkommunikation zwischen verschiedenen Gehirnregionen bietet. Es ermöglicht den Forschern, die neuronale Dynamik und Wechselwirkungen innerhalb und zwischen diesen Regionen zu erforschen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
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