Summary
Denne protokollen skisserer bruken av en spesialdesignet opptaksenhet og elektroder for å registrere lokale feltpotensialer og undersøke informasjonsflyt i musens hippocampus og prefrontale cortex.
Abstract
Teknikken for registrering av lokale feltpotensialer (LFP) er en elektrofysiologisk metode som brukes til å måle den elektriske aktiviteten til lokaliserte nevronpopulasjoner. Det fungerer som et viktig verktøy i kognitiv forskning, spesielt i hjernegrupper som hippocampus og prefrontal cortex. Doble LFP-opptak mellom disse områdene er av spesiell interesse da de tillater utforskning av interregional signalkommunikasjon. Imidlertid er metoder for å utføre disse opptakene sjelden beskrevet, og de fleste kommersielle opptaksenheter er enten dyre eller mangler tilpasningsevne for å imøtekomme spesifikke eksperimentelle design. Denne studien presenterer en omfattende protokoll for å utføre dual-electrode LFP-opptak i musehippocampus og prefrontal cortex for å undersøke effekten av antipsykotiske legemidler og kaliumkanalmodulatorer på LFP-egenskaper i disse områdene. Teknikken muliggjør måling av LFP-egenskaper, inkludert effektspektra i hver hjerneregion og sammenheng mellom de to. I tillegg er det utviklet en billig, spesialdesignet opptaksenhet for disse eksperimentene. Oppsummert gir denne protokollen et middel til å registrere signaler med høye signal-støy-forhold i forskjellige hjernegrupper, noe som letter undersøkelsen av interregional informasjonskommunikasjon i hjernen.
Introduction
Lokale feltpotensialer (LFP) refererer til den elektriske aktiviteten som er registrert fra det ekstracellulære rommet, noe som gjenspeiler den kollektive aktiviteten til en lokalisert gruppe nevroner. De viser et variert utvalg av frekvenser, som spenner fra langsomme bølger ved 1 Hz til raske svingninger ved 100 Hz eller 200 Hz. Spesifikke frekvensbånd har vært assosiert med kognitive funksjoner som læring, hukommelse og beslutningstaking 1,2. Endringer i LFP-egenskaper har blitt brukt som biomarkører for ulike nevrologiske lidelser, inkludert demens og schizofreni 3,4. Analyse av LFP-opptak kan gi verdifull innsikt i de underliggende patologiske mekanismene forbundet med disse tilstandene og potensielle terapeutiske strategier.
Dobbel LFP-opptak er en teknikk som brukes til å måle lokalisert elektrisk aktivitet innenfor og mellom to spesifikke hjernegrupper. Denne teknikken gir en verdifull mulighet til å undersøke den intrikate nevrale dynamikken og signalkommunikasjonen som forekommer i og mellom forskjellige hjernegrupper. Tidligere studier har vist at detektering av endringer i nevronegenskapene til individuelle hjernegrupper kan være komplisert, men endringer i interregional kortikal kommunikasjon kan observeres 5,6. Derfor tilbyr bruken av dobbelt LFP-opptak et kraftig middel for å løse dette problemet.
Hippocampus-prefrontal tilkobling spiller en avgjørende rolle i modulering av kognitive funksjoner, og dysfunksjon har vært knyttet til ulike nevrologiske lidelser 7,8. Opptak med to elektroder i disse områdene kan gi informasjon om disse interaksjonene. Dessverre er det begrenset informasjon tilgjengelig om metoder for å utføre dual electrode LFP-opptak mellom disse områdene. Videre er kommersielt tilgjengelige opptaksenheter generelt dyre og mangler tilpasningsevne til spesifikke eksperimentelle design. Den konvensjonelle metoden for registrering av LFP-er innebærer å bruke en skjermet kabel for å koble opptaksenheten til elektroder implantert i et dyrs hjerne. Denne tilnærmingen er imidlertid utsatt for bevegelsesartefakter og omgivelsesstøy, noe som påvirker kvaliteten og påliteligheten til de innspilte signalene.
Denne protokollen beskriver en omfattende prosedyre for å utføre dual-electrode LFP-opptak i musens hippocampus og prefrontal cortex, ved hjelp av et billig spesialdesignet headstage som kan plasseres på dyrets hode. Disse metodene gjør det mulig for forskere å undersøke regionspesifikke oscillatoriske mønstre innenfor to diskrete cerebrale regioner og utforske interregional informasjonsutveksling og tilkobling mellom disse områdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Florey Animal Ethics Committee (University of Melbourne, nr. 22-025UM) i samsvar med den australske koden for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål. C57BL/6 hannmus (8 uker), hentet fra Animal Resources Centre (Australia), ble brukt i denne studien.
1. Headstage design og fabrikasjon
NOTAT: PCB-kortet på hovedscenen er et kompakt 14 mm x 12 mm firelags brett designet for å plasseres direkte på dyrets hode. Den benytter en kommersiell forsterkerbrikke (se Materialfortegnelse), og alle design- og Gerber-filer er tilgjengelige online (GitHub-lenke: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Gi følgende spesifikasjoner til produsenten: Bretttykkelse: 0,6 mm; Minimum sporing / avstand: 4 mils; Minste hullstørrelse: 0,2 mm.
- Under PCB-monteringsprosessen, følg denne rekkefølgen:
- Lodd forsterkerbrikken på brettet med en varmluftspistol satt til 350 °C.
- Lodd de passive komponentene.
- Lodd SPI-kontakten og elektrodekontakten (se Materialfortegnelse).
- Inspiser loddingen under et mikroskop for kvalitetssikring. Fest SPI-kontakten på plass med epoksy for ekstra stabilitet.
- Bruk tredjeparts opptaksprogramvare og et kontrollkort (se Materialfortegnelse) for signalinnhenting. Se programvarens brukerhåndbok for detaljerte instruksjoner.
- Den designede headstage støtter 8 kanaler. I programvaren aktiverer du kanalene 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 og 23 for opptak.
2. Elektrode fabrikasjon
- Klipp PFA-belagte wolframtråder (se materialtabell) til bestemte lengder for forskjellige elektrodetyper: prefrontal cortex-elektrode (12 mm), hippocampuselektrode (10 mm) og jordelektrode (6 mm).
- Skjær messingrøret (se materialfortegnelse) i 3 mm segmenter.
- Fjern 2 mm av belegget på enden av hver ledning ved hjelp av en lighter, og lodd deretter elektrodetråden sikkert til messingrøret. Messingrøret har en innvendig diameter på 0,45 mm og en utvendig diameter på 0,60 mm.
- For jordelektroden, lodd en M1.2 rustfritt stålskrue (se materialtabell) til elektroden. Påfør fosforsyrebasert fluks på skruen for å forbedre lodding. Etter lodding, rengjør skruen med alkohol.
NOTAT: Bruk hansker for beskyttelse under loddeprosessen.
3. Kirurgisk prosedyre
- Bedøv musen i et anestesikammer med 3 % isofluran og 1 l/min oksygenstrøm.
- Plasser den bedøvede musen på en varmepute og fest den i en stereotaksisk ramme (se materialfortegnelse).
- Juster vedlikeholdshastigheten for isofluran til 2,5-3 % og reduser oksygenstrømmen til 500 ml/min. Bruk tåklemmen, kontroller om dyret fortsatt er under dyp anestesi.
- Injiser karprofen subkutant med 0,5 mg/kg og påfør øyesalve for øyebeskyttelse.
- Barber og steriliser musens hode ved hjelp av povidon-jod og 80% etanol.
- Gjør et 8 mm snitt langs midtlinjen i hodebunnen, fjern bindevev i snittområdet.
- Påfør hydrogenperoksid for å rengjøre overflaten av skallen, vær forsiktig så du ikke berører den omkringliggende huden.
- Juster landemerkene for bregma og lambda til samme nivå for nøyaktig elektrodeplassering (bregma og lambda er der sagittal suturen skjærer koronale og lambdoide suturer).
- Bor hull for referanse-/jordelektrode, ankerskruer (0,9 mm borbor) og aktive elektroder (0,3 mm borbor) ved spesifiserte koordinater.
- Fest den skreddersydde elektroden (trinn 2) til den stereotaktiske rammearmen og sørg for at den er vinkelrett på hjernen.
- Implanter elektroden i hippocampus CA1-området (AP - 1, 8 mm, ML - 1, 3 mm, DV - 1, 4 mm).
MERK: AP, anteroposterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventral. - Gjenta elektrodeimplantasjon i prefrontal cortex (AP - 2, 0 mm, ML - 0, 3 mm, DV - 1, 7 mm).
- Sikre elektroder med et kommersielt tilgjengelig kraftig lim og dental sement (se Materialtabell).
- Implanter to 1,2 mm ankerskruer (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) for å forhindre bevegelse.
- Plasser referanse-/jordelektroden i direkte kontakt med dura materen, 2 mm bakre og 2 mm ensidig til lambda-landemerket.
- Koble messingrørsiden av elektrodene til en flerkanals sokkelkontakt (se materialfortegnelse) med jordelektroden i midten.
- Bruk 0,8 mm varmekrympeslange på utsiden av midtpinnen for isolasjon.
- Fest elektrodene, ankerskruene og kontakten med lim og dental sement.
4. Postoperativ behandling
- For å lindre postoperativ smerte, injiser karprofen i en dose på 5-10 mg / kg subkutant hver 12-24 timer basert på en vurdering av smerte i en periode på tre dager.
- Gi dyret en ukes gjenopprettingsperiode før du starter noen opptak eller eksperimentelle prosedyrer.
5. Prosedyre for opptak
- Håndter dyret i 15 minutter, to ganger daglig, i tre påfølgende dager.
- Plukk opp musene ved å lukke hånden forsiktig rundt dem uten å bruke for mye trykk.
- Plasser headstage-brettet på dyrets hode i 30 minutter en gang om dagen i tre påfølgende dager.
- På opptaksdagen, akklimatisere dyret til opptaksrommet i 30 min.
- Plasser dyret i et lite opptakskammer i et Faraday-bur for å redusere ekstern elektrisk forstyrrelse. Fest den egendefinerte headstage for opptak.
- Åpne opptaksprogramvaren og velg en samplingsfrekvens på 2,00 kHz. Deaktiver alle kanaler unntatt 13 og 20 ved å velge hver kanal og trykke på mellomromstasten.
- I vinduet for maskinvarebåndbredde setter du den nedre båndbredden til 2 Hz og den øvre båndbredden til 100 Hz.
- I programvarefiltreringsvinduet justerer du lavpassfilteret til 100 Hz og høypassfilteret til 2 Hz.
- Velg lagringsstien ved å klikke på Velg filnavn, og klikk deretter på Record.
- Start hver innspillingsøkt med en tilvenningsperiode på 10 minutter etterfulgt av et 15 minutters baseline EEG-opptak.
- Etter baselineregistrering, administrer legemidlet via intraperitoneal injeksjon og fortsett opptaket i ytterligere 30 minutter uten forsinkelse.
MERK: Se avsnittet Resultater for detaljer om stoffene som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene vist her viser effekten av flere legemidler på lokale feltpotensialer (LFP) egenskaper testet i fire kohorter av C57BL/6 hannmus (n = 8 for hver kohort; alder: 8 uker; vekt: 24,0 ± 0,42 g). Legemidlene som ble testet inkluderte det antipsykotiske stoffet klozapin, kaliumkanalmodulatorene 4-aminopyridin (4-AP) og retigabin, samt kontrollkjøretøyets saltvann.
Som vist i figur 1 ble musen plassert i et lite opptakskammer og LFP-er ble samlet inn fra hippocampus (HIP) og prefrontal cortex (PFC) ved hjelp av en spesialdesignet headstage. Siden denne studien primært fokuserte på undersøkelsen av theta- og gammafrekvensbåndene, gjennomgikk det innspilte signalet først innledende båndpassfiltrering innenfor et frekvensområde på 2-100 Hz, etterfulgt av sampling ved 2000 Hz. Signalet ble deretter delt inn i flere 2 s epoker. Eventuelle epoker som viste markante bevegelsesartefakter ble identifisert og deretter ekskludert fra påfølgende analyseprosesser. Potensspektra av LFP i både HIP og PFC samt HIP-PFC koherens ble målt med en multi-taper-basert analysemetode9. Analysen brukte fem Slepian-tapere, og tidsbåndbredden ble satt til tre for å oppnå optimal spektralkonsentrasjon. Et skyvevindu på 1 s og en trinnstørrelse på 100 ms ble brukt til å generere tidsfrekvensspektrogrammene og tidsforløpet til HIP-PFC-koherensen.
Som vist i figur 2 og figur 3 ga ikke saltvann noen merkbare effekter på LFPs potensspektra i HIP og PFC, og heller ikke HIP-PFC-koherens. Både retigabin og klozapin viste klare reduksjoner i gammabåndstyrken (30-100 Hz) i HIP og PFC, samt gammabåndets HIP-PFC-koherens. I kontrast viste 4-AP de motsatte effektene, preget av forbedret gammabåndkraft i HIP og PFC, sammen med økt sammenheng i gammabåndet mellom HIP og PFC.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentoppsettet. Elektroder ble implantert i hippocampus (HIP) og prefrontal cortex (PFC) for registrering av lokale feltpotensialer. Dyret ble plassert i et lite opptakskammer, og en spesialdesignet headstage ble festet til elektrodekontakten. Hver innspillingsøkt startet med en 10 min baseline-økt, som ble etterfulgt av en 30 minutters stofføkt. Effektene av saltvann, klozapin, 4-AP og retigabin ble testet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Effekten av antipsykotika og kaliumkanalmodulatorer på pågående elektrofysiologisk aktivitet i hippocampus (HIP) og prefrontal cortex (PFC). Det normaliserte spektrogrammet av de lokale feltpotensialene i HIP og PFC, sammen med HIP-PFC-koherensen, viste tidsavhengige effekter for alle legemidlene som ble studert. Medikamentene ble gitt via intraperitoneal injeksjon på tidspunktet t = 15 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Virkningen av antipsykotika og kaliumkanalmodulatorer på potensspektratettheten i HIP og PFC. 4-AP forbedret gammabåndkraften betydelig i begge hjerneregioner, mens klozapin og retigabin undertrykte gammabåndskraft i begge regioner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her skisserer prosedyren for å konstruere et tilpasset headstage spesielt designet for samtidig opptak av doble lokale feltpotensialer (LFP) i hippocampus (HIP) og prefrontal cortex (PFC). De detaljerte trinnene i denne protokollen gir tilstrekkelig informasjon for forskere å grundig undersøke signalkommunikasjon både innenfor hver region og mellom HIP og PFC.
Den spesialdesignede headstagen benytter en kommersiell forsterkerbrikke. Mens den nåværende konfigurasjonen støtter opptak av 8 kanaler, kan headstage enkelt tilpasses for å imøtekomme hele 32-kanals kapasiteten, og dermed gi potensial for utvidet kanalkapasitet egnet for elektrode array-opptak. Tatt i betraktning den lave prisen på headstage, er ett alternativ å feste brettet permanent til dyrets hode. Denne tilnærmingen gir fordelen av å minimere bevegelsesartefakter og redusere det generelle nivået av forstyrrelser forårsaket av bevegelse.
Den skreddersydde elektroden demonstrerer stabil langsiktig registrering av LFP-er, og opprettholder god signalkvalitet over en periode på 3-5 måneder. En annen levedyktig tilnærming innebærer å bruke polyimidbaserte fleksible kretskort som elektrodearrayer10,11. Disse fleksible kretskortene kan integreres med opptakets headstage for å muliggjøre flerkanalsopptak. Denne metoden gir fordelen av å forenkle elektrodepreparasjon og kirurgiske prosedyrer. Vekten av implantatet med og uten headstage er veldig lett, henholdsvis 0,198 g og 0,812 g, noe som gjør den egnet for svært unge mus.
En begrensning av dagens opptaksteknikk er den potensielle forstyrrelsen forårsaket av den hengende kabelen, noe som kan forstyrre dyrets naturlige oppførsel under forsøk. For å løse dette problemet kan alternative løsninger som å bruke et SD-kort for datalagring eller implementering av en trådløs signalsendermodul vurderes.
Et viktig og kritisk trinn i protokollen innebærer nøyaktig posisjonering av elektroden. Det er avgjørende å sikre presis og konsistent elektrodeplassering for å muliggjøre sammenlignbarhet på tvers av eksperimenter. For å verifisere elektrodeplasseringen må histologi utføres12. En nyttig teknikk for å forbedre riktig elektrodeposisjonering i HPC er å registrere mens elektroden er vertikalt satt inn, da sterke theta-rytmer og nevronavfyring vil indikere riktig plassering. Det anbefales å bruke voksne mus eldre enn 8 uker, da signalkvaliteten kan avta over tid eller føre til feil plassering når musene blir eldre. Å ta hensyn til disse hensynene vil bidra til å opprettholde påliteligheten og gyldigheten av de eksperimentelle resultatene.
Avslutningsvis gir protokollen som presenteres i denne artikkelen et rammeverk for å studere signalkommunikasjonen mellom forskjellige hjernegrupper. Det gjør det mulig for forskere å utforske nevrondynamikken og interaksjonene i og mellom disse regionene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
