CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryo's
Summary
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde aanpak voor het produceren van genetisch gemodificeerde rattenmodellen. Adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt gebruikt om een DNA-reparatiesjabloon af te leveren, en elektroporatie wordt gebruikt om CRISPR-Cas9-reagentia af te leveren om het genoombewerkingsproces in een 2-cellig embryo te voltooien.
Abstract
Genoombewerkingstechnologie wordt veel gebruikt om genetisch gemodificeerde dieren, waaronder ratten, te produceren. Cytoplasmatische of pronucleaire injectie van DNA-reparatiesjablonen en CRISPR-Cas-reagentia is de meest gebruikelijke toedieningsmethode in embryo’s. Dit type micromanipulatie vereist echter toegang tot gespecialiseerde apparatuur, is arbeidsintensief en vereist een bepaald niveau van technische vaardigheid. Bovendien leiden micro-injectietechnieken vaak tot een lagere overleving van het embryo vanwege de mechanische belasting van het embryo. In dit protocol hebben we een geoptimaliseerde methode ontwikkeld om grote DNA-reparatiesjablonen te leveren die kunnen werken in combinatie met CRISPR-Cas9-genoombewerking zonder dat micro-injectie nodig is. Dit protocol combineert AAV-gemedieerde DNA-afgifte van enkelstrengs DNA-donorsjablonen samen met de afgifte van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) door elektroporatie om 2-cellige embryo’s te modificeren. Met behulp van deze nieuwe strategie hebben we met succes gerichte knock-in rattenmodellen geproduceerd met insertie van DNA-sequenties van 1,2 tot 3,0 kb groot met een efficiëntie tussen 42% en 90%.
Introduction
De ontwikkeling van op CRISPR gebaseerde genoombewerkingstools heeft ons vermogen versneld om efficiënt nieuwe en meer geavanceerde genetisch gemanipuleerde rattenmodellen te genereren. Single-guide RNA, samen met Cas9-nuclease, wordt gecombineerd om Ribonucleoproteïne (RNP)-complexen te vormen die zich richten op DNA-sequenties die van belang zijn binnen het genoom en resulteren in dubbelstrengs DNA-breuken. Omdat cellulaire DNA-reparatiemechanismen foutgevoelig zijn, worden inserties en deleties (INDEL’s) geïntroduceerd tijdens het reparatieproces die de functie van een doelgen kunnen verstoren. Wanneer er sprake is van gelijktijdige afgifte van een gewenste gemanipuleerde DNA-sequentie (reparatiesjabloon) samen met genoombewerkingsreagentia, vindt het inbrengen van de reparatiesjabloon in het gebied met de dubbelstrengs DNA-breuk plaats via een proces dat homologiegerichte reparatie (HDR) wordt genoemd. Dit is een effectieve strategie voor het genereren van diermodellen met gerichte DNA-inserties/-substituties (knock-ins). Een beperking is dat knock-in-sequenties vaak groot zijn, waarvan is aangetoond dat het de efficiëntie van het bewerken van genen vermindert, waardoor het genereren van het gewenste model moeilijker wordt1. Strategieën om de knock-in-efficiëntie te verhogen, omvatten linearisatie van zowel dubbelstrengs DNA (dsDNA) als enkelstrengs DNA (ssDNA) reparatiesjablonen en chemische modificatie van DNA-reparatiesjablonen 2,3,4. Bovendien zijn pronucleaire micro-injectie samen met HDR-stimulerende verbindingen, toepassing van elektrische pulsen in combinatie met micro-injectie en getimede micro-injectie in 2-cellige embryo’s allemaal 5,6,7 geprobeerd. Ondanks het succes van sommige van deze benaderingen blijft de integratie van DNA-sequenties groter dan 1,0 kb technisch uitdagend.
Elektroporatie, een veelgebruikte methode om reagentia in gekweekte cellijnen te brengen, biedt een alternatief voor micro-injectie voor het afleveren van CRISPR-Cas9-componenten in embryo’s. Embryo-elektroporatie, voor het eerst aangetoond in rattenembryo’s8, is sindsdien met succes gebruikt als toedieningsmethode bij muizen 9,10,11,12,13, varkens 14,15 en andere diermodelorganismen 16,17,18 . Embryo’s, gesuspendeerd in het medium dat CRISPR-Cas9-reagentia bevat, worden in een cuvet of op een glasplaatje tussen twee elektroden geplaatst en onderworpen aan directe pulsen van elektrische stromen. Hierdoor ontstaan voorbijgaande openingen in de zona pellucida en het plasmamembraan van het embryo waardoor de CRISPR-Cas9-componenten de embryo’s binnendringen. Meestal worden elektrische “poring”-pulsen op middelhoog niveau gebruikt om de tijdelijke openingen te creëren, gevolgd door elektrische “overdrachtspulsen” op een lager niveau die de beweging van de negatief geladen genoombewerkingscomponenten vergemakkelijken. Embryo-elektroporatie is efficiënt, heeft een hoge doorvoer en is eenvoudig uit te voeren. Hoewel is aangetoond dat embryo-elektroporatie zeer succesvol is voor de introductie van kleine (<200 bp) ssDNA-reparatiesjablonen, zijn er weinig meldingen van succesvolle elektroporatie van grotere (>1,0 kb) reparatiesjablonen13,19. Deze beperking van de grootte vormt een belangrijke beperking van de elektroporatie van embryo’s voor het genereren van knock-in diermodellen die grote inserties vereisen.
In de context van gentherapie worden adeno-geassocieerde virussen (AAV’s) al lang gebruikt als voertuigen om genetisch materiaal af te leveren vanwege hun efficiënte in vivo infectiviteit van zowel delende als niet-delende cellen, gebrek aan pathogeniteit en zeldzame genomische integratie20,21. Onlangs hebben meer studies AAV’s gecombineerd met CRISPR-Cas9-technologie om DNA-reparatiesjablonen en CRISPR-reagentia te introduceren 22,23,24. Deze aanpak maakt het mogelijk om grotere DNA-reparatiesjablonen te leveren zonder dat er micro-injectietechnieken nodig zijn.
De HDR-route is actiever in de late S- en G2-fasen van de celcyclus25,26. In in vitro uitgevoerde onderzoeken werd een significante toename van de knock-in-efficiëntie bereikt door afgifte van CRISPR-Cas9 RNP’s en DNA-reparatiesjablonen in G2-gesynchroniseerde cellen of door beperking van de aanwezigheid van Cas9-eiwit tot late S- en G2-fasen met behulp van een Cas9-Geminin-fusie-eiwit2. Bovendien is er een belangrijke zygote genoomactivering (ZGA) die optreedt tijdens de verlengde G2-fase van het embryo in het 2-cellige stadium, en dit wordt geassocieerd met een open chromatinetoestand. Er wordt gespeculeerd dat dit de CRISPR-Cas9 RNP’s en reparatiesjablonen een grotere toegankelijkheid van het genomische DNA geeft.
Ons doel was om voort te bouwen op al deze observaties, door de AAV-benadering te combineren met embryo-elektroporatie om CRISPR-Cas9 RNP’s te introduceren in het 2-cellige stadium van embryo-ontwikkeling. Deze strategie maakt gebruik van de grotere capaciteit voor het afleveren van DNA-reparatiesjablonen van AAV, het technische gemak van elektroporatie en het meer optimale 2-cellige tijdstip voor genomische toegankelijkheid tijdens de ontwikkeling van embryo’s om een efficiënte methode te creëren voor gerichte genetische manipulatie van DNA-inserties. Zoals benadrukt in dit protocol, maakt onze geoptimaliseerde methode de productie mogelijk van gerichte knock-in rattenmodellen met inserties van DNA-sequenties van 1,2 tot 3,0 kb groot zonder dat micro-injectietechnieken nodig zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het CRISPR-Cas-genoombewerkingssysteem heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van genetische manipulatie door de efficiënte productie van zowel eenvoudige als complexe, op maat gemaakte genetische modificaties in een verscheidenheid aan diersoorten mogelijk te maken. Frequente verfijningen en verbeteringen in technieken die verband houden met genoombewerking vergroten de veelzijdigheid ervan. Hier hebben we een nieuwe aanpak beschreven met behulp van ssAAV-gemedieerde DNA-afgifte samen met 2-cellige embryo-ele…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Nolan Davis bedanken voor zijn hulp bij videografie en videobewerking.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
