Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células
Summary
Este protocolo presenta un enfoque optimizado para la producción de modelos de ratas modificadas genéticamente. El virus adenoasociado (AAV) se utiliza para administrar una plantilla de reparación de ADN, y la electroporación se utiliza para administrar reactivos CRISPR-Cas9 para completar el proceso de edición del genoma en un embrión de 2 células.
Abstract
La tecnología de edición genómica se utiliza ampliamente para producir animales modificados genéticamente, incluidas las ratas. La inyección citoplasmática o pronuclear de plantillas de reparación de ADN y reactivos CRISPR-Cas es el método de administración más común en embriones. Sin embargo, este tipo de micromanipulación requiere el acceso a equipos especializados, es laboriosa y requiere un cierto nivel de habilidad técnica. Además, las técnicas de microinyección a menudo dan como resultado una menor supervivencia embrionaria debido al estrés mecánico en el embrión. En este protocolo, desarrollamos un método optimizado para entregar grandes plantillas de reparación de ADN para que funcionen junto con la edición del genoma CRISPR-Cas9 sin necesidad de microinyección. Este protocolo combina la entrega de ADN mediada por AAV de plantillas de donantes de ADN monocatenario junto con la administración de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) por electroporación para modificar embriones de 2 células. Utilizando esta novedosa estrategia, hemos producido con éxito modelos de ratas knock-in dirigidas que llevan la inserción de secuencias de ADN de 1,2 a 3,0 kb de tamaño con eficiencias entre el 42% y el 90%.
Introduction
El desarrollo de herramientas de edición genómica basadas en CRISPR ha acelerado nuestra capacidad para generar de manera eficiente modelos de ratas modificados genéticamente nuevos y más sofisticados. El ARN de guía única, junto con la nucleasa Cas9, se combina para formar complejos de ribonucleoproteína (RNP) que se dirigen a secuencias de ADN de interés dentro del genoma y dan lugar a roturas de ADN bicatenario. Debido a que los mecanismos de reparación del ADN celular son propensos a errores, se introducen inserciones y deleciones (INDEL) durante el proceso de reparación que pueden interrumpir la función de un gen diana. Cuando hay una entrega conjunta de una secuencia de ADN modificada deseada (plantilla de reparación) junto con reactivos de edición del genoma, la inserción de la plantilla de reparación en la región que contiene la rotura del ADN bicatenario se produce a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología (HDR). Se trata de una estrategia eficaz para generar modelos animales con inserciones/sustituciones de ADN dirigidas (knock-ins). Una limitación es que las secuencias knock-in suelen ser de gran tamaño, lo que se ha demostrado que reduce la eficiencia de la edición de genes, lo que dificulta la generación del modelo deseado1. Las estrategias para aumentar la eficiencia de los knock-in han incluido la linealización de las plantillas de reparación de ADN bicatenario (dsDNA) y ADN monocatenario (ssDNA) y la modificación química de las plantillas de reparación del ADN 2,3,4. Además, se ha intentado la microinyección pronuclear junto con compuestos estimulantes HDR, la aplicación de pulsos eléctricos junto con la microinyección y la microinyección programada en embriones de 2 células 5,6,7. A pesar del éxito de algunos de estos enfoques, la incorporación de secuencias de ADN de más de 1,0 kb sigue siendo un reto técnico.
La electroporación, que es un método común para introducir reactivos en líneas celulares cultivadas, ofrece una alternativa a la microinyección para administrar componentes CRISPR-Cas9 en embriones. La electroporación embrionaria, demostrada por primera vez en embriones de rata8, se ha utilizado desde entonces con éxito como método de administración en ratones 9,10,11,12,13, cerdos14,15 y otros organismos modelo animal 16,17,18. Los embriones, suspendidos en el medio que contiene los reactivos CRISPR-Cas9, se colocan en una cubeta o en un portaobjetos de vidrio entre dos electrodos y se someten a pulsos directos de corrientes eléctricas. Esto crea aberturas transitorias en la zona pelúcida y en la membrana plasmática embrionaria a través de las cuales los componentes CRISPR-Cas9 entran en los embriones. Por lo general, se utilizan pulsos eléctricos de “poro” de nivel medio para crear las aberturas temporales seguidas de “pulsos de transferencia” eléctricos de nivel inferior que facilitan el movimiento de los componentes de edición del genoma cargados negativamente. La electroporación embrionaria es eficiente, tiene un alto rendimiento y es fácil de realizar. Sin embargo, mientras que la electroporación embrionaria ha demostrado ser muy exitosa para la introducción de plantillas de reparación de ADNs pequeñas (<200 pb), hay pocos informes de electroporación exitosa de plantillas de reparación más grandes (>1,0 kb)13,19. Esta restricción de tamaño representa una limitación importante de la electroporación embrionaria para generar modelos animales knock-in que requieren grandes inserciones.
En el contexto de la terapia génica, los virus adenoasociados (AAV) se han utilizado durante mucho tiempo como vehículos para entregar material genético debido a su eficiente infectividad in vivo de células en división y no división, falta de patogenicidad y rara integración genómica20,21. Recientemente, más estudios han combinado los AAV con la tecnología CRISPR-Cas9 para introducir plantillas de reparación de ADN y reactivos CRISPR 22,23,24. Este enfoque permite la entrega de plantillas de reparación de ADN más grandes sin necesidad de técnicas de microinyección.
La vía HDR es más activa en las fases tardías S y G2 del ciclo celular25,26. En estudios realizados in vitro, se lograron aumentos significativos en la eficiencia de knock-in mediante la administración de RNP CRISPR-Cas9 y plantillas de reparación de ADN en células sincronizadas con G2 o mediante la restricción de la presencia de la proteína Cas9 a las fases S y G2 tardías utilizando una proteína de fusión Cas9-Geminina2. Además, hay un evento importante de activación del genoma cigótico (ZGA) que ocurre durante la fase G2 extendida del embrión en etapa de 2 células, y esto se asocia con un estado de cromatina abierta. Se especula que esto proporciona a los RNPs CRISPR-Cas9 y a las plantillas de reparación una mayor accesibilidad al ADN genómico.
Nuestro objetivo era basarnos en todas estas observaciones, combinando el enfoque AAV con la electroporación embrionaria para introducir RNPs CRISPR-Cas9 en la etapa de 2 células del desarrollo embrionario. Esta estrategia aprovecha la mayor capacidad de entrega de plantillas de reparación de ADN de AAV, la facilidad técnica de la electroporación y el punto de tiempo más óptimo de 2 células para la accesibilidad genómica durante el desarrollo embrionario para crear un método eficiente para la ingeniería genética dirigida de las inserciones de ADN. Como se destaca en este protocolo, nuestro método optimizado permite la producción de modelos de ratas knock-in dirigidas que llevan inserciones de secuencias de ADN de 1,2 a 3,0 kb de tamaño sin necesidad de técnicas de microinyección.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de edición genómica CRISPR-Cas ha revolucionado el campo de la ingeniería genética al permitir la producción eficiente de modificaciones genéticas personalizadas tanto sencillas como complejas en una variedad de especies animales. Los frecuentes refinamientos y mejoras en las técnicas asociadas con la edición del genoma aumentan su versatilidad. Aquí hemos descrito un nuevo enfoque que utiliza la entrega de ADN mediada por ssAAV junto con la electroporación embrionaria de 2 células de reactivos CRIS…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Nolan Davis por su ayuda con la videografía y la edición de video.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
