아데노 관련 바이러스(AAV) 및 2세포 배아 전기천공법을 이용한 쥐 배아의 CRISPR-Cas9 게놈 편집
Summary
이 프로토콜은 유전자 변형 쥐 모델을 생산하기 위한 최적화된 접근 방식을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 DNA 복구 템플릿을 전달하는 데 사용되며, 전기천공법은 CRISPR-Cas9 시약을 전달하여 2세포 배아에서 게놈 편집 과정을 완료하는 데 사용됩니다.
Abstract
게놈 편집 기술은 쥐를 포함한 유전자 변형 동물을 생산하는 데 널리 사용됩니다. DNA 복구 템플릿과 CRISPR-Cas 시약의 세포질 또는 전핵 주입은 배아에 전달하는 가장 일반적인 방법입니다. 그러나 이러한 유형의 미세 조작은 특수 장비에 대한 접근이 필요하고 힘들며 일정 수준의 기술이 필요합니다. 더욱이, 미세주입 기술은 종종 배아에 가해지는 기계적 스트레스로 인해 배아 생존율을 낮춥니다. 이 프로토콜에서는 미세주입 없이 CRISPR-Cas9 게놈 편집과 함께 작동하는 대규모 DNA 복구 템플릿을 제공하는 최적화된 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 단일 가닥 DNA 공여 템플릿의 AAV 매개 DNA 전달과 전기천공에 의한 CRISPR-Cas9 리보핵단백질(RNP) 전달을 결합하여 2세포 배아를 변형합니다. 이 새로운 전략을 사용하여 42%에서 90% 사이의 효율로 1.2-3.0kb 크기의 DNA 염기서열을 삽입하는 표적 knock-in rat 모델을 성공적으로 생산했습니다.
Introduction
CRISPR 기반 게놈 편집 도구의 개발은 새롭고 더 정교한 유전자 조작 쥐 모델을 효율적으로 생성하는 능력을 가속화했습니다. 단일 가이드 RNA는 Cas9 뉴클레아제와 함께 결합되어 게놈 내에서 관심 있는 DNA 염기서열을 표적으로 하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하고 이중 가닥 DNA 절단을 초래합니다. 세포 DNA 복구 메커니즘은 오류가 발생하기 쉽기 때문에 복구 과정에서 삽입 및 결실(INDEL)이 도입되어 표적 유전자의 기능을 방해할 수 있습니다. 게놈 편집 시약과 함께 원하는 조작된 DNA 염기서열(복구 템플릿)의 동시 전달이 있는 경우, 이중 가닥 DNA 절단을 포함하는 영역에 복구 템플릿의 삽입은 상동성 유도 복구(HDR)라는 프로세스를 통해 발생합니다. 이는 표적 DNA 삽입/치환(knock-in)을 통해 동물 모델을 생성하는 데 효과적인 전략입니다. 한 가지 한계는 knock-in 염기서열의 크기가 큰 경우가 많아 유전자 편집 효율이 감소하여 원하는 모델을 생성하기가 더 어려워진다는 것입니다1. knock-in 효율을 높이기 위한 전략에는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 및 단일 가닥 DNA(ssDNA) 복구 템플릿의 선형화와 DNA 복구 템플릿의 화학적 변형이 포함됩니다 2,3,4. 또한, HDR 자극 화합물과 함께 전핵 미세주입, 미세주입과 함께 전기 펄스의 적용, 2세포 배아에 대한 시간 미세주입이 모두 시도되었습니다 5,6,7. 이러한 접근 방식 중 일부의 성공에도 불구하고 1.0kb보다 큰 DNA 서열의 통합은 기술적으로 어려운 과제로 남아 있습니다.
배양된 세포주에 시약을 도입하는 일반적인 방법인 전기천공법은 CRISPR-Cas9 성분을 배아에 전달하기 위한 미세주입의 대안을 제공합니다. 쥐 배아(rat embryo)8에서 처음 증명된 배아 전기천공법(embryo electroporation)은 이후 마우스(9,10,11,12,13), 돼지(14,15) 및 기타 동물 모델 유기체(16,17,18)에서 전달 방법으로 성공적으로 사용되었다 . CRISPR-Cas9 시약이 포함된 배지에 현탁된 배아는 큐벳 또는 두 전극 사이의 유리 슬라이드에 배치되고 직접 전류 펄스를 받습니다. 이로 인해 CRISPR-Cas9 구성 요소가 배아로 들어가는 zona pellucida 및 배아 원형질막에 일시적인 구멍이 생깁니다. 전형적으로, 중간 수준의 전기 “포링” 펄스는 음전하를 띤 게놈 편집 성분의 이동을 용이하게 하는 낮은 수준의 전기 “전달 펄스”에 이어 임시 개구부를 생성하는 데 사용됩니다. 배아 전기천공법은 효율적이고, 처리량이 높으며, 수행하기 쉽습니다. 그러나, 배아 전기천공법은 작은(<200 bp) ssDNA 복구 주형의 도입에 대해 매우 성공적인 것으로 나타났지만, 더 큰(>1.0 kb) 복구 주형의 성공적인 전기천공법에 대한 보고는 거의 없다13,19. 이러한 크기 제한은 큰 삽입이 필요한 knock-in 동물 모델을 생성하기 위한 배아 전기천공법의 주요 한계를 나타냅니다.
유전자 치료의 맥락에서 아데노 관련 바이러스(AAV)는 분열 및 비분열 세포 모두의 효율적인 생체 내 감염성, 병원성 부족 및 희귀 게놈 통합으로 인해 유전 물질을 전달하는 매개체로 오랫동안 사용되어 왔습니다20,21. 최근에는 AAV와 CRISPR-Cas9 기술을 결합하여 DNA 복구 템플릿과 CRISPR 시약을 도입하는 연구가 더 많아지고있습니다 22,23,24. 이 접근법을 사용하면 미세주입 기술 없이 더 큰 DNA 복구 템플릿을 전달할 수 있습니다.
HDR 경로는 세포주기의 후기 S 및 G2 단계에서 더 활성화됩니다25,26. in vitro에서 수행된 연구에서 CRISPR-Cas9 RNP 및 DNA 복구 템플릿을 G2 동기화 세포에 전달하거나 Cas9-Geminin 융합 단백질2을 사용하여 Cas9 단백질의 존재를 후기 S 및 G2 단계로 제한함으로써 knock-in 효율이 크게 증가했습니다. 또한, 2세포 단계 배아의 확장된 G2 단계에서 발생하는 주요 접합 게놈 활성화(ZGA) 이벤트가 있으며, 이는 개방 염색질 상태와 관련이 있습니다. 이를 통해 CRISPR-Cas9 RNP와 복구 템플릿에 게놈 DNA에 대한 접근성을 높일 수 있을 것으로 추측됩니다.
우리의 목표는 AAV 접근법과 배아 전기천공법을 결합하여 배아 발달의 2세포 단계에서 CRISPR-Cas9 RNP를 도입함으로써 이러한 모든 관찰을 기반으로 하는 것이었습니다. 이 전략은 AAV의 더 큰 DNA 복구 템플릿 전달 용량, 전기천공법의 기술적 용이성 및 배아 발달 중 게놈 접근성을 위한 보다 최적의 2세포 시점을 활용하여 DNA 삽입의 표적 유전 공학을 위한 효율적인 방법을 만듭니다. 이 프로토콜에서 강조된 바와 같이, 당사의 최적화된 방법을 사용하면 미세주입 기술 없이 1.2-3.0kb 크기의 DNA 염기서열을 삽입하는 표적 knock-in rat 모델을 생산할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas 게놈 편집 시스템은 다양한 동물 종에서 간단하고 복잡한 맞춤형 유전자 변형을 효율적으로 생산할 수 있도록 함으로써 유전 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 게놈 편집과 관련된 기술의 빈번한 개선과 개선은 그 다양성을 더욱 강화합니다. 여기서는 CRISPR-Cas9 시약을 2세포 설치류 배아에 주입하는 2세포 배아 전기천공법과 함께 ssAAV 매개 DNA 전달을 사용하는 새로운 접근법을 설명했습?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 비디오 촬영 및 비디오 편집에 도움을 준 Nolan Davis에게 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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