CRISPR-Cas9 Genomredigering av råttembryon med hjälp av adenoassocierat virus (AAV) och 2-cells embryoelektroporation
Summary
Detta protokoll presenterar ett optimerat tillvägagångssätt för att producera genetiskt modifierade råttmodeller. Adeno-associerat virus (AAV) används för att leverera en DNA-reparationsmall, och elektroporering används för att leverera CRISPR-Cas9-reagenser för att slutföra genomredigeringsprocessen i 2-cellsembryo.
Abstract
Genomredigeringsteknik används i stor utsträckning för att producera genetiskt modifierade djur, inklusive råttor. Cytoplasmatisk eller pronukleär injektion av DNA-reparationsmallar och CRISPR-Cas-reagenser är den vanligaste leveransmetoden till embryon. Denna typ av mikromanipulation kräver dock tillgång till specialutrustning, är mödosam och kräver en viss nivå av teknisk skicklighet. Dessutom leder mikroinjektionstekniker ofta till lägre embryoöverlevnad på grund av den mekaniska påfrestningen på embryot. I detta protokoll utvecklade vi en optimerad metod för att leverera stora DNA-reparationsmallar för att fungera tillsammans med CRISPR-Cas9-genomredigering utan behov av mikroinjektion. Detta protokoll kombinerar AAV-medierad DNA-leverans av enkelsträngade DNA-donatormallar tillsammans med leverans av CRISPR-Cas9-ribonukleoprotein (RNP) genom elektroporering för att modifiera 2-cellsembryon. Med hjälp av denna nya strategi har vi framgångsrikt producerat riktade knock-in-råttmodeller som bär insättning av DNA-sekvenser från 1,2 till 3,0 kb i storlek med effektivitet mellan 42 % och 90 %.
Introduction
Utvecklingen av CRISPR-baserade genredigeringsverktyg har påskyndat vår förmåga att effektivt generera nya och mer sofistikerade genetiskt modifierade råttmodeller. Enkelstyrt RNA, tillsammans med Cas9-nukleas, kombineras för att bilda ribonukleoproteinkomplex (RNP) som riktar sig mot DNA-sekvenser av intresse inom genomet och resulterar i dubbelsträngade DNA-brott. Eftersom cellulära DNA-reparationsmekanismer är felbenägna, introduceras insättningar och deletioner (INDEL) under reparationsprocessen som kan störa en målgens funktion. När det finns samleverans av en önskad konstruerad DNA-sekvens (reparationsmall) tillsammans med genomredigeringsreagenser, sker insättning av reparationsmallen i regionen som innehåller det dubbelsträngade DNA-brottet genom en process som kallas homologiriktad reparation (HDR). Detta är en effektiv strategi för att generera djurmodeller med riktade DNA-insättningar/substitutioner (knock-ins). En begränsning är att knock-in-sekvenser ofta är stora i storlek, vilket har visat sig minska genredigeringseffektiviteten, vilket gör det svårare att generera den önskade modellen1. Strategier för att öka knock-in-effektiviteten har inkluderat linjärisering av både dubbelsträngat DNA (dsDNA) och enkelsträngat DNA (ssDNA) reparationsmallar och kemisk modifiering av DNA-reparationsmallar 2,3,4. Dessutom har pronukleär mikroinjektion tillsammans med HDR-stimulerande föreningar, applicering av elektriska pulser i samband med mikroinjektion och tidsinställd mikroinjektion i 2-cellsembryon alla försökts 5,6,7. Trots framgången med vissa av dessa metoder är det fortfarande tekniskt svårt att införliva DNA-sekvenser som är större än 1,0 kb.
Elektroporering, som är en vanlig metod för att föra in reagenser i odlade cellinjer, erbjuder ett alternativ till mikroinjektion för att leverera CRISPR-Cas9-komponenter till embryon. Embryoelektroporering, som först demonstrerades i råttembryon8, har sedan dess framgångsrikt använts som leveransmetod i möss 9,10,11,12,13, grisar 14,15 och andra djurmodellorganismer 16,17,18. Embryon, suspenderade i mediet som innehåller CRISPR-Cas9-reagenser, placeras i en kyvett eller på en glasskiva mellan två elektroder och utsätts för direkta pulser av elektrisk ström. Detta skapar övergående öppningar i zona pellucida och embryots plasmamembran genom vilka CRISPR-Cas9-komponenterna kommer in i embryona. Vanligtvis används elektriska “poring”-pulser på mellannivå för att skapa de tillfälliga öppningarna följt av elektriska “överföringspulser” på lägre nivå som underlättar rörelsen av de negativt laddade genomredigeringskomponenterna. Embryoelektroporering är effektiv, har hög genomströmning och är lätt att utföra. Men medan embryoelektroporering har visat sig vara mycket framgångsrik för införandet av små (<200 bp) ssDNA-reparationsmallar, finns det få rapporter om framgångsrik elektroporering av större (>1,0 kb) reparationsmallar13,19. Denna storleksbegränsning utgör en stor begränsning av embryoelektroporering för att generera knock-in-djurmodeller som kräver stora insättningar.
I samband med genterapi har adenoassocierade virus (AAV) länge använts som bärare av genetiskt material på grund av deras effektiva infektionsförmåga in vivo av både delande och icke-delande celler, brist på patogenicitet och sällsynt genomisk integration20,21. Nyligen har fler studier kombinerat AAVs med CRISPR-Cas9-teknik för att introducera DNA-reparationsmallar och CRISPR-reagenser 22,23,24. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att leverera större DNA-reparationsmallar utan behov av mikroinjektionstekniker.
HDR-vägen är mer aktiv i de sena S- och G2-faserna av cellcykeln25,26. I studier utförda in vitro uppnåddes signifikanta ökningar av knock-in-effektiviteten genom tillförsel av CRISPR-Cas9 RNP:er och DNA-reparationsmallar till G2-synkroniserade celler eller genom begränsning av närvaron av Cas9-protein till sena S- och G2-faser med hjälp av ett Cas9-Geminin-fusionsprotein2. Dessutom finns det en stor zygotisk genomaktivering (ZGA) som inträffar under den förlängda G2-fasen av embryot i 2-cellsstadiet, och detta är associerat med ett öppet kromatintillstånd. Det spekuleras i att detta ger CRISPR-Cas9 RNP:er och reparationsmallar större tillgänglighet till det genomiska DNA:t.
Vårt mål var att bygga vidare på alla dessa observationer genom att kombinera AAV-metoden med embryoelektroporering för att introducera CRISPR-Cas9 RNP i 2-cellsstadiet av embryoutvecklingen. Denna strategi drar nytta av den större leveranskapaciteten för DNA-reparationsmallen hos AAV, den tekniska lättheten med elektroporering och den mer optimala 2-cellstidpunkten för genomisk tillgänglighet under embryoutveckling för att skapa en effektiv metod för riktad genmodifiering av DNA-insättningar. Som framgår av detta protokoll möjliggör vår optimerade metod produktion av riktade knock-in-råttmodeller som bär insättningar av DNA-sekvenser från 1,2 till 3,0 kb i storlek utan behov av mikroinjektionstekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas-systemet för genredigering har revolutionerat gentekniken genom att möjliggöra effektiv produktion av både enkla och komplexa, skräddarsydda genetiska modifieringar i en mängd olika djurarter. Frekventa förfiningar och förbättringar av tekniker i samband med genomredigering ytterligare gör den mångsidigare. Här har vi beskrivit ett nytt tillvägagångssätt som använder ssAAV-medierad DNA-leverans tillsammans med 2-cells embryoelektroporering av CRISPR-Cas9-reagenser till 2-cells gnagarembryon. Vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Nolan Davis för hjälp med videografi och videoredigering.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
