Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule
Summary
Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l’elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell’embrione a 2 cellule.
Abstract
La tecnologia di editing del genoma è ampiamente utilizzata per produrre animali geneticamente modificati, compresi i ratti. L’iniezione citoplasmatica o pronucleare di modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR-Cas è il metodo di somministrazione più comune negli embrioni. Tuttavia, questo tipo di micromanipolazione richiede l’accesso ad attrezzature specializzate, è laborioso e richiede un certo livello di abilità tecnica. Inoltre, le tecniche di microiniezione spesso comportano una minore sopravvivenza dell’embrione a causa dello stress meccanico sull’embrione. In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo ottimizzato per fornire modelli di riparazione del DNA di grandi dimensioni da lavorare in combinazione con l’editing del genoma CRISPR-Cas9 senza la necessità di microiniezioni. Questo protocollo combina la somministrazione di DNA mediata da AAV di modelli di donatori di DNA a singolo filamento con la somministrazione della ribonucleoproteina CRISPR-Cas9 (RNP) mediante elettroporazione per modificare gli embrioni a 2 cellule. Utilizzando questa nuova strategia, abbiamo prodotto con successo modelli mirati di ratto knock-in con inserzione di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb con efficienze comprese tra il 42% e il 90%.
Introduction
Lo sviluppo di strumenti di editing del genoma basati su CRISPR ha accelerato la nostra capacità di generare in modo efficiente nuovi e più sofisticati modelli di ratti geneticamente modificati. L’RNA a guida singola, insieme alla nucleasi Cas9, viene combinato per formare complessi di ribonucleoproteina (RNP) che prendono di mira le sequenze di DNA di interesse all’interno del genoma e provocano rotture del DNA a doppio filamento. Poiché i meccanismi di riparazione del DNA cellulare sono soggetti a errori, durante il processo di riparazione vengono introdotte inserzioni e delezioni (INDEL) che possono interrompere la funzione di un gene bersaglio. Quando c’è la co-consegna di una sequenza di DNA ingegnerizzato desiderata (modello di riparazione) insieme a reagenti di editing del genoma, l’inserimento del modello di riparazione nella regione contenente la rottura del DNA a doppio filamento avviene attraverso un processo chiamato riparazione diretta dall’omologia (HDR). Si tratta di una strategia efficace per la generazione di modelli animali con inserzioni/sostituzioni mirate di DNA (knock-in). Una limitazione è che le sequenze knock-in sono spesso di grandi dimensioni, il che ha dimostrato di ridurre l’efficienza dell’editing genetico, rendendo così più difficile la generazione del modello desiderato1. Le strategie per aumentare l’efficienza knock-in hanno incluso la linearizzazione dei modelli di riparazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) e del DNA a singolo filamento (ssDNA) e la modifica chimica dei modelli di riparazione del DNA 2,3,4. Inoltre, sono state tentate la microiniezione pronucleare insieme a composti stimolanti l’HDR, l’applicazione di impulsi elettrici in combinazione con la microiniezione e la microiniezione temporizzata in embrioni a 2 cellule 5,6,7. Nonostante il successo di alcuni di questi approcci, l’incorporazione di sequenze di DNA più grandi di 1,0 kb rimane tecnicamente impegnativa.
L’elettroporazione, che è un metodo comune per introdurre reagenti in linee cellulari in coltura, offre un’alternativa alla microiniezione per la somministrazione di componenti CRISPR-Cas9 negli embrioni. L’elettroporazione embrionale, dimostrata per la prima volta negli embrioni di ratto8, è stata da allora utilizzata con successo come metodo di somministrazione nei topi 9,10,11,12,13, nei suini 14,15 e in altri organismi modello animali 16,17,18. Gli embrioni, sospesi nel terreno contenente i reagenti CRISPR-Cas9, vengono posti in una cuvetta o su un vetrino tra due elettrodi e sottoposti a impulsi diretti di correnti elettriche. Questo crea aperture transitorie nella zona pellucida e nella membrana plasmatica dell’embrione attraverso le quali i componenti CRISPR-Cas9 entrano negli embrioni. Tipicamente, gli impulsi elettrici di “poring” di medio livello vengono utilizzati per creare le aperture temporanee seguite da “impulsi di trasferimento” elettrici di livello inferiore che facilitano il movimento dei componenti di editing del genoma caricati negativamente. L’elettroporazione embrionale è efficiente, ha un’elevata produttività ed è facile da eseguire. Tuttavia, mentre l’elettroporazione embrionale ha dimostrato di avere un grande successo per l’introduzione di modelli di riparazione di ssDNA di piccole dimensioni (<200 bp), ci sono poche segnalazioni di successo dell’elettroporazione di modelli di riparazione più grandi (>1,0 kb)13,19. Questa restrizione dimensionale rappresenta una delle principali limitazioni dell’elettroporazione embrionale per la generazione di modelli animali knock-in che richiedono grandi inserimenti.
Nel contesto della terapia genica, i virus adeno-associati (AAV) sono stati a lungo utilizzati come veicoli per veicolare materiale genetico grazie alla loro efficiente infettività in vivo delle cellule in divisione e non in divisione, alla mancanza di patogenicità e alla rara integrazione genomica20,21. Recentemente, altri studi hanno combinato gli AAV con la tecnologia CRISPR-Cas9 per introdurre modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR 22,23,24. Questo approccio consente la consegna di modelli di riparazione del DNA più grandi senza la necessità di tecniche di microiniezione.
La via HDR è più attiva nelle ultime fasi S e G2 del ciclo cellulare25,26. Negli studi condotti in vitro, sono stati ottenuti aumenti significativi dell’efficienza knock-in mediante la somministrazione di RNP CRISPR-Cas9 e modelli di riparazione del DNA in cellule sincronizzate con G2 o limitando la presenza della proteina Cas9 alle fasi S e G2 tardive utilizzando una proteina di fusione Cas9-Geminina2. Inoltre, c’è un evento di attivazione del genoma zigotico maggiore (ZGA) che si verifica durante la fase G2 estesa dell’embrione allo stadio di 2 cellule, e questo è associato a uno stato di cromatina aperta. Si ipotizza che questo fornisca agli RNP CRISPR-Cas9 e ai modelli di riparazione una maggiore accessibilità al DNA genomico.
Il nostro obiettivo era quello di basarci su tutte queste osservazioni, combinando l’approccio AAV con l’elettroporazione embrionale per introdurre gli RNP CRISPR-Cas9 nella fase a 2 cellule dello sviluppo embrionale. Questa strategia sfrutta la maggiore capacità di rilascio del modello di riparazione del DNA dell’AAV, la facilità tecnica dell’elettroporazione e il punto temporale più ottimale a 2 cellule per l’accessibilità genomica durante lo sviluppo embrionale per creare un metodo efficiente per l’ingegneria genetica mirata delle inserzioni di DNA. Come evidenziato in questo protocollo, il nostro metodo ottimizzato consente la produzione di modelli di ratto knock-in mirati che trasportano inserzioni di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb senza la necessità di tecniche di microiniezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di editing genomico CRISPR-Cas ha rivoluzionato il campo dell’ingegneria genetica consentendo la produzione efficiente di modificazioni genetiche personalizzate sia semplici che complesse in una varietà di specie animali. I frequenti perfezionamenti e miglioramenti nelle tecniche associate all’editing del genoma ne aumentano ulteriormente la versatilità. Qui abbiamo descritto un nuovo approccio che utilizza la somministrazione di DNA mediata da ssAAV insieme all’elettroporazione embrionale a 2 cellule dei re…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Nolan Davis per l’assistenza nella videografia e nel montaggio video.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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