Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines primaires pour la modélisation in vitro
Summary
Ce protocole décrit la procédure d’obtention et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires (EPR) à partir d’yeux porcins d’origine locale. Ces cellules constituent une alternative de haute qualité aux cellules souches et conviennent à la recherche rétinienne in vitro .
Abstract
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cruciale dans la rétine externe responsable du soutien des photorécepteurs. La dégénérescence de l’EPR survient généralement dans les maladies marquées par une perte de vision progressive, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La recherche sur la DMLA repose souvent sur des yeux de donneurs humains ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) pour représenter l’EPR. Cependant, ces sources d’EPR nécessitent des périodes de différenciation prolongées et une expertise substantielle pour la culture. De plus, certains instituts de recherche, en particulier ceux des zones rurales, n’ont pas facilement accès aux yeux des donneurs. Bien qu’il existe une lignée cellulaire d’EPR immortalisée disponible dans le commerce (ARPE-19), elle ne présente pas les caractéristiques essentielles de l’EPR in vivo et n’est pas largement acceptée dans de nombreuses publications de recherche en ophtalmologie. Il est urgent d’obtenir des cellules primaires représentatives de l’EPR à partir d’une source plus facilement disponible et plus rentable. Ce protocole élucide l’isolement et de la sous-culture de cellules primaires de l’EPR obtenues post-mortem à partir d’yeux porcins, qui peuvent être obtenues localement auprès de fournisseurs commerciaux ou universitaires. Ce protocole nécessite des matériaux courants que l’on trouve généralement dans les laboratoires de culture tissulaire. Le résultat est une alternative primaire, différenciée et rentable aux iPSC, aux yeux de donneurs humains et aux cellules ARPE-19.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche située dans la rétine externe entre la membrane de Bruch et les photorécepteurs1. Les cellules de l’EPR forment des jonctions serrées avec des protéines telles que la zonula occludens-1 (ZO-1) et possèdent un phénotype distinctif caractérisé par la pigmentation et la morphologie hexagonale 2,3. Ces cellules contribuent à la barrière hémato-rétinienne, soutenant ainsi la santé des photorécepteurs et maintenant l’homéostasie rétinienne 4,5. De plus, les cellules RPE jouent un rôle essentiel dans la vision en absorbant la lumière et en recyclant les composants essentiels pour les photorécepteurs6. Par exemple, RPE65, une protéine fortement exprimée dans les cellules RPE, convertit les esters de rétinyle tout-trans en rétinol 11-cis 7,8. Compte tenu de la multitude de fonctions remplies par les cellules EPR, leur dysfonctionnement est impliqué dans diverses maladies, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge et la rétinopathie diabétique 9,10. Pour améliorer la compréhension des pathologies rétiniennes et développer de nouveaux traitements, des modèles in vitro de la rétine sont fréquemment utilisés.
Pour générer des modèles représentatifs de rétines saines ou malades, il est impératif d’utiliser un type de cellule RPE mimétique. La lignée cellulaire ARPE-19 disponible dans le commerce n’a pas de phénotypes natifs, tels que la pigmentation, tandis que les iPSC peuvent prendre des mois pour se différencier 11,12,13. Bien que les yeux de donneurs humains puissent être idéaux, ils ne sont souvent pas facilement accessibles à de nombreux laboratoires de recherche.
Ici, nous avons conçu une méthode pour utiliser les yeux porcins, qui partagent de nombreuses similitudes avec les yeux humains14, pour obtenir des cellules primaires de l’EPR. Ces cellules primaires de l’EPR porcine ont été utilisées dans plusieurs modèles rétiniens15,16. Non seulement ces cellules sont rentables, mais elles nécessitent également moins de temps à acquérir que les iPSC ou les yeux du donneur. De plus, ils présentent des caractéristiques natives, telles que la pigmentation et les microvillosités. Bien qu’il existe des protocoles similaires pour l’extraction de l’EPR porcin 17,18,19, cette technique simple et détaillée valide davantage la dissociation enzymatique et utilise des matériaux couramment trouvés dans la plupart des laboratoires de culture cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit comment isoler les cellules EPR des yeux porcins. La pigmentation et la morphologie des pavés sont observées dans les 7 jours suivant l’isolement (Figure 1B). De plus, les données TEER indiquent la formation de jonctions serrées22 et une monocouche saine (Figure 5). Ces résultats montrent que les cellules EPR isolées avec cette méthode sont similaires à l’EPR humaine et peuvent être bénéfiques dans les …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Farhad Farjood pour son aide dans la culture et l’isolement de cellules EPR porcines et Thomas Harris pour son aide dans le MEB. Les auteurs remercient le soutien de la plateforme de microscopie de l’Université d’État de l’Utah pour l’analyse MEB. L’installation entretient un microscope électronique à balayage acquis grâce à une subvention d’instrumentation de recherche majeure de la National Science Foundation (CMMI-1337932). Le financement de cette étude a été fourni par les National Institutes of Health par le biais de la subvention 1R15EY028732 (Vargis) et d’une subvention de la Fondation BrightFocus M2019109 (Vargis). Un financement supplémentaire a été fourni par une subvention de recherche de premier cycle et d’opportunités créatives (Weatherston) du Bureau de la recherche de l’Université d’État de l’Utah et une subvention de démarrage (Vargis) du Centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer et la démence de l’Université d’État de l’Utah.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
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