İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.
Abstract
Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada fotoreseptörleri desteklemekten sorumlu çok önemli bir tek tabakadır. RPE dejenerasyonu genellikle yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi ilerleyici görme kaybıyla kendini gösteren hastalıklarda görülür. AMD üzerine yapılan araştırmalar genellikle RPE’yi temsil etmek için insan donör gözlerine veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC’ler) dayanır. Bununla birlikte, bu RPE kaynakları, uzun farklılaşma süreleri ve kültürleme için önemli uzmanlık gerektirir. Ek olarak, bazı araştırma kurumları, özellikle kırsal alanlardakiler, donör gözlerine kolay erişimden yoksundur. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş bir RPE hücre dizisi (ARPE-19) mevcut olsa da, temel in vivo RPE özelliklerinden yoksundur ve birçok oftalmoloji araştırma yayınında yaygın olarak kabul görmemektedir. Temsili primer RPE hücrelerini daha kolay bulunabilen ve uygun maliyetli bir kaynaktan elde etmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, domuz gözlerinden ölüm sonrası elde edilen ve yerel olarak ticari veya akademik tedarikçilerden temin edilebilen primer RPE hücrelerinin izolasyonunu ve alt kültürünü açıklar. Bu protokol, tipik olarak doku kültürü laboratuvarlarında bulunan ortak materyalleri gerektirir. Sonuç, iPSC’lere, insan donör gözlerine ve ARPE-19 hücrelerine birincil, farklılaştırılmış ve uygun maliyetli bir alternatiftir.
Introduction
Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada Bruch zarı ile fotoreseptörlerarasında bulunan bir tek tabakadır 1. RPE hücreleri, zonula okcludens-1 (ZO-1) gibi proteinlerle sıkı bağlantılar oluşturur ve pigmentasyon ve altıgen morfoloji 2,3 ile karakterize edilen ayırt edici bir fenotipe sahiptir. Bu hücreler kan-retina bariyerine katkıda bulunur, böylece fotoreseptör sağlığını destekler ve retina homeostazını korur 4,5. Ek olarak, RPE hücreleri, ışığı emerek ve fotoreseptörler için gerekli bileşenleri geri dönüştürerek görmede kritik bir rol oynar6. Örneğin, RPE hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir protein olan RPE65, all-trans retinil esterleri 11-cis retinol 7,8’e dönüştürür. RPE hücreleri tarafından gerçekleştirilen çok sayıda işlev göz önüne alındığında, işlev bozuklukları yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynar 9,10. Retina patolojilerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için retinanın in vitro modelleri sıklıkla kullanılmaktadır.
Sağlıklı veya hastalıklı retinaların temsili modellerini oluşturmak için, mimetik bir RPE hücre tipi kullanmak zorunludur. Ticari olarak temin edilebilen ARPE-19 hücre hattı, pigmentasyon gibi doğal fenotiplerden yoksunken, iPSC’lerin 11,12,13’ü ayırt etmesi aylar alabilir. İnsan donör gözleri ideal olsa da, çoğu araştırma laboratuvarı için genellikle hazır değildir.
Burada, birincil RPE hücrelerini elde etmek için insan gözüyle14 birçok benzerliği paylaşan domuz gözlerini kullanmak için bir yöntem geliştirdik. Bu primer domuz RPE hücreleri, çoklu retinal modellerdekullanılmıştır 15,16. Bu hücreler sadece uygun maliyetli olmakla kalmaz, aynı zamanda iPSC’lerden veya donör gözlerinden daha az zaman gerektirirler. Ek olarak, pigmentasyon ve mikrovillus gibi doğal özellikler sergilerler. Domuz RPE ekstraksiyonu için benzer protokoller mevcut olsada 17,18,19, bu basit ve ayrıntılı teknik, enzimatik ayrışmayı daha da doğrular ve çoğu hücre kültürü laboratuvarında yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, RPE hücrelerinin domuz gözlerinden nasıl izole edileceğini açıklar. İzolasyondan sonraki 7 gün içinde pigmentasyon ve parke taşı morfolojisi görülür (Şekil 1B). Ayrıca, TEER verileri sıkı bağlantı oluşumunu22 ve sağlıklı bir tek tabakayı göstermektedir (Şekil 5). Bu sonuçlar, bu yöntemle izole edilen RPE hücrelerinin insan RPE’sine benzer olduğunu ve retina hücre kültürü modellerinde faydal?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, domuz RPE hücre kültürü ve izolasyonu ile ilgili yardımları için Farhad Farjood’a ve SEM ile ilgili yardımları için Thomas Harris’e teşekkür eder. Yazarlar, SEM analizi için Utah Eyalet Üniversitesi’ndeki Mikroskopi Çekirdek Tesisi’nin desteğini kabul ediyor. Tesis, Ulusal Bilim Vakfı Büyük Araştırma Enstrümantasyon Hibesi (CMMI-1337932) aracılığıyla edinilen bir taramalı elektron mikroskobuna sahiptir. Bu çalışmanın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Hibe 1R15EY028732 (Vargis) ve BrightFocus Vakfı Hibe M2019109 (Vargis) aracılığıyla sağlanmıştır. Ek finansman, Utah Eyalet Üniversitesi Araştırma Ofisi’nden bir Lisans Araştırma ve Yaratıcı Fırsatlar Hibesi (Weatherston) ve Utah Eyalet Üniversitesi Alzheimer Hastalığı ve Demans Araştırma Merkezi’nden bir tohum hibesi (Vargis) tarafından sağlandı.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
