Summary
Multiplex cyklisk immunhistokemi tillader in situ detektion af flere markører samtidigt ved hjælp af gentagen antigen-antistofinkubation, billedscanning og billedjustering og integration. Her præsenterer vi driftsprotokollen til identifikation af immuncellesubstrater med denne teknologi i lungekræft og parrede hjernemetastaseprøver.
Abstract
Tumormikromiljøet involverer interaktioner mellem værtsceller, tumorceller, immunceller, stromale celler og vaskulatur. Karakterisering og rumlig organisering af immuncelleundergrupper og målproteiner er afgørende for prognostiske og terapeutiske formål. Dette har ført til udviklingen af multipleksede immunhistokemiske farvningsmetoder. Multiplexfluorescens immunhistokemi tillader samtidig påvisning af flere markører, hvilket letter en omfattende forståelse af cellefunktion og intercellulære interaktioner. I dette papir beskriver vi en arbejdsgang for multiplexcyklisk fluorescerende immunhistokemisk assay og dens anvendelse i kvantificeringsanalysen af lymfocytundergrupper. Den multiplex cykliske fluorescerende immunhistokemiske farvning følger lignende trin og reagenser som standard immunhistokemi, der involverer antigenhentning, cyklisk antistofinkubation og farvning på et formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) vævsglas. Under antigen-antistofreaktionen fremstilles en blanding af antistoffer fra forskellige arter. Betingelser, såsom antigenhentningstid og antistofkoncentration, optimeres og valideres for at øge signal-støj-forholdet. Denne teknik er reproducerbar og fungerer som et værdifuldt værktøj til immunterapiforskning og kliniske anvendelser.
Introduction
Hjernemetastaser (BM) repræsenterer de mest almindelige tumorer i centralnervesystemet (CNS), der forekommer i næsten halvdelen af ikke-småcellet lungekræft tilfælde (NSCLC), med en dårlig prognose1. Det anslås, at 10%-20% af NSCLC-patienterne allerede har BM på tidspunktet for den første diagnose, og ca. 40% af NSCLC-tilfældene vil udvikle BM i løbet af behandling2. Tumormikromiljøet (TME) er tæt forbundet med NSCLC-forekomst og BM, herunder forskellige komponenter, såsom blodkar, fibroblaster, makrofager, ekstracellulær matrix (ECM), lymfoid, knoglemarvsafledte immunceller og signalmolekyler 3,4. Mikromiljømæssige immunceller spiller en afgørende rolle i at påvirke kræftcellevækst og udvikling. Hjernemetastaser præsenterer adskillige potentielle behandlingsmål præget af komplekse immunologiske mikromiljøer og signalprocesser. For eksempel har PD-1-hæmmere vist klinisk effekt hos patienter med lungekræft hjernemetastase (LCBM) som en immun-checkpoint-hæmmer (ICI). Imidlertid varierer hyppigheden af respons på PD-1-behandling mellem primær NSCLC og LCBM5, hvilket tyder på, at tumorimmunmikromiljøet fungerer som en kritisk ICI-regulator.
Immunohistokemi (IHC) er et uvurderligt værktøj inden for biologi, grundmedicin og patologi6. Denne detektionsmetode visualiserer antigenekspression gennem interaktionen mellem antigen-antistof på et vævsglas7. IHC bruges til diagnosticering af prædiktive markører, evaluering af prognostiske markører, vejledning af målrettede terapier og udforskning af tumorcellernes biologiske funktioner8. Den traditionelle IHC-metode kan dog kun detektere én biomarkør ad gangen. For at imødegå denne begrænsning har innovationen af immunhistokemisk teknologi ført til udviklingen af multiplex fluorescens immunohistokemi (mfIHC), som muliggør samtidig identifikation af flere proteinmarkører på det samme vævsglas, både i lyst felt og fluorescerende felt9. Dette fremskridt giver nøjagtig analyse af cellesammensætning og molekylære interaktioner mellem stromale celler, immunceller og kræftceller inden for TME.
I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for multiplex cyklisk immunhistokemi til analyse af den rumlige fordeling af immunceller. To primære antistoffer af forskellige arter, såsom kanin og rotte, vælges til inkubation samtidigt, efterfulgt af fluorescensmærkede sekundære antistoffer. Antigenudtagning udføres efter hver runde af antigen-antistofreaktion. Autofluorescens er blokeret, og 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) anvendes til farvning af kernerne. Panelet inkluderer sekventiel påvisning af CD3, CD8, CD20 og CK, celler kategoriseres efter markørerne: tumorceller (CK +), modne T-celler (CD3 +), cytotoksiske T-celler (CD3 + CD8 +), B-celler (CD20 +) 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev godkendt af den medicinske etiske komité på Yunnan Cancer Hospital / det tredje tilknyttede hospital i Kunming Medical University. Alle forsøgspersoner/værger underskrev informeret samtykke.
1. Forberedelse af dias
- Skær sektioner af parrede parparrede paraffinblokke indeholdende primær lungetumor eller lungekræfthjernemetastaser celler i en tykkelse på 4 μm ved hjælp af et mikrotom. Fjern sektioner til vand og adskil med pincet, vælg den bedste og fastgør den på det polylysinbelagte dias.
- Servietglassene anbringes i en ovn ved 65 °C i 30 minutter for at forbedre vævets vedhæftning.
- Dyp diasene i xylen gennem tre ændringer, der hver varer i 10 minutter.
- Gradvist reducere alkoholkoncentrationen og inkubere dias i 100% ethanol i 5 min, 90% ethanol i 5 min, 75% ethanol i 5 min og i deioniseret vand i 3 min.
2. Varmeinduceret epitophentning (HIER)
- Fortynd 100x natriumcitratbufferopløsning (pH 6,0) til 1x (10 mM) i deioniseret vand, og forbered tilstrækkelig bufferopløsning til helt at nedsænke diasene.
- Anbring lysbillederne i en trykkoger, og udsæt dem for høj varme (100 °C) og tryk (~30 psi) i 2 minutter. Efter opvarmning afkøles diasene til stuetemperatur i destilleret vand i 3 minutter.
- En pakke med 52 g fosfatbufret saltvand (PBS; pulveriseret) opløses i 5 liter deioniseret vand til fremstilling af PBS-stødpudeopløsning (pH 7,0). Placer diasene i PBS-bufferopløsning i 5 minutter med 3 ændringer.
3. Peroxidase blokering
- Dæk sektionerne med 3% hydrogenperoxid og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Skyl lysbillederne i PBS, 3x i 5 min hver.
- Brug filterpapir til at absorbere overskydende vand væk fra vævets omkreds. I mellemtiden skal du sørge for, at vævet er fugtigt.
4. Inkubation af primært antistof i første runde
- Der fremstilles en arbejdsblanding af de primære antistoffer mod CD8 (kaninmonoklonalt antistof, klon SP16) og CD20 (musemonoklonalt antistof, klon L26), fortyndet 1:50 i fortyndingsmiddel mod Bond-primært antistof.
- Tilsæt antistofkomplekset på sektionerne og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Der fremstilles en opløsning af 0,1 % Tween/fosfatbufret saltvand: 1 ml Tween i 1 liter PBS-bufferopløsning.
- Vask sektionerne med 0,1% Tween/fosfatbufret saltvand, 3x i 5 min hver. Brug filterpapir til at trække overskydende vand væk fra vævets omkreds, i mellemtiden skal du sørge for, at vævet er fugtigt.
5. Sekundær antistofinkubation til første runde
- Forbered en blanding af fluorescensmærket gedeanti-kaninantistof (excitation (Ex): 495 nm) og gedeanti-museantistof (Ex: 578 nm), fortyndet 1:50 i fosfatbuffersaltvand. Gedeanti-kanin-antistoffet binder sig til det primære antistof af CD8, og gede-antimuseantistoffet binder sig til det primære antistof af CD20.
- Tilsæt den sekundære antistofblanding dråbevis og inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
6. Varmeinduceret epitophentning og peroxidaseblokering
- Fortynd 100x natriumcitrat (pH 6,0) til 1x (10 mM) i deioniseret vand, og forbered tilstrækkelig bufferopløsning til helt at nedsænke diasene.
- Anbring gliderne i en trykkoger og udsæt dem for høj varme (100 °C) og tryk (~30 psi) i 1 min. Efter opvarmning anbringes objektglassene i destilleret vand for at afkøle til stuetemperatur i 3 minutter.
- Udfør peroxidaseblokering som beskrevet i trin 3.
7. Inkubation af primært antistof til anden runde
- Der fremstilles en arbejdsblanding af de primære antistoffer mod CD3 (kaninmonoklonalt antistof, klon SP7) og CK (musemonoklonalt antistof, MX005), fortyndet 1:50 i primær antistoffortyndingsmiddel.
- Tilsæt antistofkomplekset på sektionerne og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask med 0,1% Tween/fosfatbufret saltvand, 3x i 5 min hver. Brug filterpapir til at trække overskydende vand væk fra vævets omkreds, i mellemtiden skal du sørge for, at vævet er fugtigt.
8. Sekundær antistofinkubation til anden runde
- Forbered gedeantikanin (Ex: 652 nm) og gedeanti-museantistof (Ex: 590 nm) blanding, fortynding 1:50 i fosfatbuffersaltvand. Gedeanti-kanin-antistoffet binder sig til det primære antistof af CD3, og gede-antimuseantistoffet binder sig til det primære antistof af CK.
- Tilsæt sekundær antistofblanding dråbevis, inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Vask med 0,1% Tween/fosfatbufret saltvand, 3x i 5 min hver.
9. Autofluorescensdæmpning og DAPI-farvning
- Der tilsættes reagens (0,15 M/L KMnO4) til vævssektionen i 1 min. Skyl med rindende vand i 5 min.
FORSIGTIG: KMnO4 er giftig og beskadiger huden. Sørg for at bære handsker, når du håndterer diasene. Hvis væsken drypper på huden, skal du tørre den hurtigt af med rene servietter og skylle med rindende vand. - Tør diaset med stigende koncentrationer af alkohol (70%, 90%, 100%), i 3 minutter i hver koncentration.
- Tilføj DAPI og coverslip til multispektral billeddannelse. Mængden af DAPI afhænger af vævsstørrelsen. Sørg for, at vævet er helt dækket af DAPI, efter at dækslet er tilføjet.
10. Diasscanning
- Placer lysbillederne på en bakke, og tryk, indtil den ikke kan skubbes længere.
- For at starte programmet skal du dobbeltklikke på programikonet på skrivebordet. Under opstart vises vinduet til valg af tilstand. Valgvinduet viser to brightfield- og fluorescerende tilstande: automatisk tilstand og manuel tilstand. I fluorescerende scanningstilstand skal du klikke på Automatisk tilstand.
- Flyt musemarkøren over ? for at få vist oplysninger om indstillingerne. Klik på Filterindstilling > Filterkanal for at vælge kanalnummer > pseudofarve. Definer farven og gem.
- Klik på Rutinearbejde > Scanningstilstand > Fuldautomatisk. Klik på Rutinearbejde > Slidenavn for at definere slidenavn til output. Klik på Rutinearbejde > Kanalindstillinger for at vælge filtre.
- Klik på Rutinearbejde > scanningsindstillinger for at bestemme den resulterende kvalitet og lagerplacering for det virtuelle dias.
- Klik på Eksempel for tærskelindstilling og valg af det område, der skal scannes.
- Klik på Hardware > filtre > Live > autofokus > automatisk eksponering > digital forstærkning > Marker Brug manuel eksponeringstid > Marker for at begrænse området > Indstil strøm.
- Klik på Rutinearbejde > Start scanning. Vælg forstørrelsesniveau som 20x eller 40x. Vælg 20x for passende filstørrelser. MRXS-udvidelse er defineret af 3D Pannoramic MIDI-scanner. Billedudvidelse kan også ændres til TIFF-billede.
- Klik på Slidefremviser > Multiview Toolbox for at vælge billedet til konfokal og derefter justere og integrere billedet.
11. Kvantitativ evaluering af celletætheder
- Kvantificer procentdele af positive immunceller (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) i tumor- og stromaområder med Halo 10-scannersoftware. Valider CK-farvning for at definere tumorvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en protokol til cyklisk antigendetektion ved hjælp af 5-farve multiplexfluorescens på et enkelt dias. Gennem vores optimering af analysen muliggør vi inkubation af to antistoffer fra forskellige arter (figur 1). De nødvendige anordninger til eksperimentproceduren inkluderer en trykkoger og immunfarvningsboks (figur 2A).
Efter afslutningen af analysen definerer vi pseudofarve på de fire markører, før vi scanner diasene. Pseudofarverne på CD3, CD8, CD20 og CK er henholdsvis gul, rød, grøn og cyan. Kernerne er mærket med DAPI. Repræsentative regioner af tumor og stroma vælges til analyse. Fluorescerende spektrum ved 495 nm, 578 nm, 652 nm og 590 nm optages ved hjælp af 3D automatisk digital diasscanner. Et repræsentativt stakbillede og enkeltmærkede billeder i lungekræfthjernemetastaservæv er vist i figur 2B. Baseret på billeder, der indeholder enkeltmarkørfluorescenssignal, ekstraherede scannersoftwaren cellefænotypeegenskaber baseret på pseudofarve. Tilsvarende antal positive immunceller og samlede immunceller blev også talt. Hvert farvet proteinniveau kvantificeres i det detekterede væv ved at beregne H-score12. Efter disse procedurer tælles og analyseres antallet af hver tumorinfiltrerende lymfocyttype og andelen af hver celletype i det samlede antal målceller. Andelen af hver immuncelletype præsenterer den effektive procentdel af tumorinfiltrerende lymfocytter. Procentdelen af CD3 +, CD3 + CD8 + T-celler og CD20 + B-celler blev analyseret i lungekræfthjernemetastaser sammenlignet med primære lungekræftsektioner. Repræsentative resultater er vist i figur 3. Tætheden af immunceller (CD3 + T-celler, CD3 + CD8 + T-celler) er lavere i lungekræft hjernemetastaser end primær lungekræft. CD20+ B-celler er højere i hjernemetastasegruppen end den primære lungekræftgruppe. Resultaterne er imidlertid ikke signifikant forskellige mellem disse to grupper for de begrænsede prøver.
Figur 1: Arbejdsproces for multiplex cyklisk fluorescens immunohistokemisk farvning. De 4 μm sektioner skæres og klæbes på klæbende glide. Følgende driftstrin udføres: afparaffinisering og rehydrering, antigenhentning, antigenhentning, antigenblokering, inkubation af primær antistofblanding, sekundær antistofinkubation og derefter gentagelse af trinene til antigenhentning, antigenblokering, inkubation af primær antistofblanding og sekundær antistofinkubation efterfulgt af reduktion af autofluorescens, valg af passende filter til diasscanning og analyse af resultaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Driftsmetoder til multiplex fluorescens immunohistokemisk farvning. Antigenbehandling udføres ved opvarmning af sektioner i en trykkoger. (A) Trykkogeren bruges til varmeinduceret epitophentning. I processen med antistofinkubation placeres diasene i immunfarvningsboksen. (B) Repræsentative sammensatte og enkeltfarvede billeder for panelet, der anvendes i lungekræft, hjernemetastaser, væv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immuncellernes andel inden for primær lungekræft og lungekræft hjernemetastaser. CD3+, CD3+CD8+, CD20+ immunceller andel i fire lungekræft hjernemetastaser væv er lavere end parrede primære lungekræft væv (fejlbjælker: Standardafvigelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet processen for multiplex cyklisk fluorescens immunohistokemisk farvning. Den primære antistofudvælgelse er et afgørende aspekt af fluorescensimmunohistokemisk assay, og monoklonale antistoffer anbefales for bedre specificitet og repeterbarhed. For at optimere arbejdskoncentrationen af det primære antistof er en række fortyndinger blevet testet gennem immunohistokemiske eksperimenter. Både positive kontroller (til vurdering af målantigenekspression) og negative kontroller (ingen primær antistofinkubation) er afgørende og bør oprettes.
I denne protokol fortyndes de primære antistoffer og fremstilles til en blanding fra forskellige arter. De fluorescensmærkede sekundære antistoffer samles og inkuberes også på samme måde, afledt af forskellige arter. Så det kritiske trin er at vælge arten for forskellige primære antistoffer baseret på antigenerne, og det monoklonale antistof foretrækkes sammenlignet med polyklonalt antistof. Disse kan sikre, at kombinationen mellem primært antistof og sekundært antistof er specifik. Den blandede væske skal opnå arbejdskoncentrationen for både primære antistoffer, og krydsreaktivitet bør ikke eksistere mellem de to antistoffer samtidigt. Hvis de primære antistoffer er af samme art, inkuberes et sekundært antistof først, derefter det andet. Ved bestemmelse af sekvensen af primær antistofinkubation i et panel bør der gives prioritet til antistoffer, der er følsomme over for antigen-antistofreaktionen, for antigener med lav ekspression vil intensiteten styrkes under anden epitopudtagning. Før den anden runde af antistofinkubation tager gentagen antigenudtagning kortere tid (1 min) sammenlignet med den første operation (2 min). Fluorescensintensiteten fra tidligere cyklisk farvning vil ikke falde, selvom sektionerne gennemgår varmeinduceret hentning to gange. For at undgå ikke-specifik immunreaktivitet skal inkubationsbetingelserne optimeres, herunder antistofarbejdskoncentration, inkubationstid og omgivelsestemperatur.
Forskellige metoder til epitophentning er blevet udviklet i de seneste årtier, primært opdelt i varmeinduceret epitophentning (HIER) og proteaseinduceret epitophentning (PIER). Opvarmning er en effektiv antigenudtagningsmetode, der eksponerer antigenepitoper, hvilket gør dem mere effektivt detekteret af antistoffer13. De to vigtigste muligheder for antigenudtagning er baseret på citratbuffer og EDTA-buffer med høj pH14. Den optimerede hentningstilstand identificeres i henhold til målantigenet.
Autofluorescens kan interferere med fluorescerende billeddannelse på sektioner forårsaget af endogene fluoroforer og reagenser, der anvendes til vævsbehandling15. Anvendelse af et associeret reagens er nødvendig til eluering. Fluoroforer vælges med emissionstoppe, hvor autofluorescenstoppe undgås (ca. 490 nm)16,17. Sudan Black B og NaBH4 er blevet rapporteret for slukning af vævs autofluorescens18,19. Kombinationen af Sudan Black B og NaBH4 reducerede fluorescensbaggrund i målrettet renal formalinfikseret paraffinindlejret væv20. I denne protokol er vævsbehandlingen af KMnO4 i en koncentration på 0,15 M / L tidsbesparende i 1 min. KMnO4 dækker et lag på vævet til afskærmning af spontan fluorescens og reducerer baggrundsfluorescens, den specifikke farvning af detekteret protein er mere visualiseret.
Hele diasene scannes i fire forskellige filterkanaler, billedjusteringsanalyse er nødvendig, det er en stor udfordring at justere lokaliseringen af enkeltcelle- og subcellulære strukturer. For multispektrale billeder fra denne teknik er professionelt lysbilledbehandlingsudstyr og kvantitativ analysesoftware nødvendig for at undgå spektral krydstale. De dyre omkostninger ved instrumentet begrænser dets anvendelse. Co-inkubation af to antistoffer sparer tid, især når man beskæftiger sig med et 6-markørpanel, hvilket kræver 3 inkubationscyklusser. Denne teknik bruges til at visualisere mere detaljeret karakterisering af immunceller i tumorimmunmikromiljøer. Metoden vil fremover blive anvendt til kvantitativ analyse af tumorassocierede tertiære lymfoide strukturer.
Sammenfattende gør multiplex cyklisk fluorescens immunhistokemi det muligt at farve flere mål af individuelt mærkede fluoroforer på et enkelt dias. Dette assay giver en forbedret forståelse af den rumlige fordeling af celler i tumorimmunmikromiljøet, og den rumlige nærhed af tumorimmunceller bidrager til screening af patienter, der vil have gavn af immunterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have syntes at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan Province (2019J1274).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
