Summary
Protokollen beskriver hårete rotinduksjon ved hjelp av Arabidopsis primære blomsterstandsstengler og Brassica napus hypocotyls. De hårete røttene kan dyrkes og brukes som eksplanter for å regenerere transgene planter.
Abstract
Hårete rottransformasjon representerer et allsidig verktøy for plantebioteknologi i ulike arter. Infeksjon av en Agrobacterium-stamme som bærer et rotinduserende (Ri) plasmid induserer dannelsen av hårete røtter på sårstedet etter overføring av T-DNA fra Ri-plasmidet til plantegenomet. Protokollen beskriver i detalj prosedyren for injeksjonsbasert hårrotinduksjon i Brassica napus DH12075 og Arabidopsis thaliana Col-0. De hårete røttene kan brukes til å analysere et transgen av interesse eller behandles for generering av transgene planter. Regenereringsmedium som inneholder cytokinin 6-benzylaminopurin (5 mg/L) og auxin 1-naftaleneddiksyre (8 mg/L) fremkaller vellykket skudddannelse hos begge arter. Protokollen dekker genotyping og seleksjon av regeneranter og T1-planter for å oppnå planter som bærer et transgen av interesse og fri for T-DNA fra Ri-plasmidet. En alternativ prosess som fører til dannelsen av en sammensatt plante er også avbildet. I dette tilfellet holdes hårete røtter på skuddet (i stedet for de naturlige røttene), noe som muliggjør studier av et transgen i hårete rotkulturer i sammenheng med hele planten.
Introduction
Plantetransformasjon er flaskehalsen i enhver genetisk studie i plantebiologi. En jordbåren bakterie, Agrobacterium tumefaciens, er mye brukt som et middel for genlevering ved blomsterdukkert eller vevskultur for å generere transformanter. A. tumefaciens infiserer planter på et sårsted og forårsaker svulster på grunn av overføring og integrering av T-DNA fra et tumorinduserende (Ti) plasmid i vertsplantegenomet. Konstruerte A. tumefaciens-stammer med modifisert Ti-plasmid uten villtype T-DNA og en binær vektor med kunstig T-DNA og kloningssteder for å sette inn et gen av interesse brukes ofte som et effektivt plantetransformasjonssystem1. Imidlertid er mange modellarter og avlinger gjenstridige mot blomsterdukkert eller in vitro planteregenerering eller har lange vekstsykluser, noe som påvirker effektiviteten til dette transformasjonssystemet.
Agrobacterium rhizogenes induserer dannelsen av utilsiktede røtter, eller hårete røtter, på sårstedet etter å ha infisert en vertsplante. I likhet med A. tumefaciens overfører A. rhizogenes et T-DNA fra et rotinduserende (Ri) plasmid til vertsplantegenomet, noe som forårsaker utvikling av transgene hårete røtter. Denne prosessen styres hovedsakelig av roten onkogene loci (rol) gener 2,3. Ved å bruke agrobakteriestammer som bærer både Ri-plasmidet og en kunstig binær vektor som koder for et gen av interesse, har hårete rotkulturer blitt brukt til å produsere rekombinante proteiner, analysere funksjonen til promotorer eller gener, eller redigere genomer ved hjelp av Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) 4,5,6.
Vår protokoll bruker den transkonjugante stammen Ti-less A. tumefaciens C58C1 som bærer Ri-plasmidet pRiA4b7. T-DNA av Ri-plasmidet består av to regioner, høyre og venstre T-DNA (HENHOLDSVIS TR-DNA og TL-DNA), som uavhengig kan integreres i plantegenomet8. Ved å utnytte dette systemet ble den langvarige eksplanttransformasjonsprosessen i Brassica napus DH12075 cultivar optimalisert9. Protokollen beskrevet nedenfor tillater regenerering av utvalgte hårete rotlinjer og oppnå T1-planter som bærer transgenet av interesse og fri for rolgener på omtrent 1 år. Den injeksjonsbaserte hårete rottransformasjonen kan brukes i andre Brassicaceae-arter, som vist ved å transformere Arabidopsis thaliana Col-0. Mens hypocotyl brukes til å transformere B. napus, injiseres A. thaliana i den primære blomsterstandsstammen.
Protocol
1. Forberedelse av medier og løsninger
- Forbered hormonlagerløsningene.
- For fremstilling av 50 ml 1-naftaleneddiksyre (NAA), 6-benzylaminopurin (BAP) og indol-3-smørsyre (IBA) stamløsning med en konsentrasjon på 5 mg/ml, oppløs 250 mg av pulverisert hormon i 2 ml 1 M natriumhydroksid (NaOH) og juster volumet til 50 ml med ultrarent vann.
- For å forberede 50 ml gibberellsyre (GA3) med en konsentrasjon på 1 mg / ml, oppløs 50 mg pulverisert hormon i 2 ml etanol og juster volumet til 50 ml ultrarent vann.
- Filtrer oppløsningen med et sterilt sprøytefilter med 0,22 μm porestørrelse og fordel den i sterile 2 ml rør for oppbevaring. Oppbevar oppløsningen ved -20 °C eller 4 °C, avhengig av produsentens anbefalinger.
- Forbered antibiotikaoppløsninger. For 50 ml cefotaksim og ticarcillin dinatriumoppløsning med en konsentrasjon på 100 mg/ml, oppløs 0,5 g pulverisert antibiotika i 40 ml ultrarent vann og juster til et endelig volum på 50 ml. Filtrer oppløsningen med et sterilt sprøytefilter med 0,22 μm porestørrelse og fordel den i sterile 2 ml rør for oppbevaring. Oppbevar oppløsningen ved -20 °C.
MERK: Antibiotika og hormoner tilsettes alltid til det avkjølte mediet. - Forbered 1 liter Luria Broth (LB) medium ved å tilsette 10 g bacto-trypton, 5 g gjærekstrakt og 5 g natriumklorid (NaCl) i en 1 L målesylinder og juster volumet til 1 L med dobbelt destillert vann. Juster pH til 7,0 med KOH med en pH-måler (i henhold til produsentens instruksjoner). Overfør oppløsningen til en 1 l flaske og tilsett 15 g bakteriologisk agar (1,5%), hvis et fast medium fremstilles og autoklav mediet. Tilsett om nødvendig passende antibiotika (bakteriell resistens bæres på den binære vektoren) til det avkjølte mediet.
MERK: Bruk en autoklav til å sterilisere løsningen. Legg flasken i kurven, lukk lokket og steriliser den i 20 minutter ved 121 °C og 98,9 kPa. Denne protokollen brukes alltid til autoklaverløsninger i videre trinn. - Forbered 1 l gjærekstraktbiff (YEB) medium ved å blande 5 g biffekstrakt, 1 g gjærekstrakt, 5 g pepton, 5 g sukrose og 0,5 g magnesiumklorid (MgCl2) i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L. Overfør oppløsningen til en 1 l flaske. Autoklav mediet.
- Forbered 1 liter medium for frøspredning ved å blande 2,2 g Murashige og Skoog (MS) pulver, 10 g sukrose (1%) og 0,5 g 2- (N-Morfolino) etansulfonsyre (MES) natriumsalter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør løsningen til en 1 l flaske og tilsett 8 g planteagar (0,8%). Autoklav mediet.
- Forbered 1 liter plantevekstmedium ved å blande 2,2 g MS-pulver, 5 g sukrose (0,5%) og 0,5 g MES-salter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør oppløsningen til en 1 l flaske og tilsett 8 g planteagar (0,8 %). Autoklav mediet.
- Forbered 1 l hårete rotvekstmedium ved å blande 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 30 g sukrose (3%) og 0,5 g MES-salter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH, og overfør oppløsningen til en 1 l flaske. Tilsett 3 g geleringsmiddel (0,3%) og autoklav mediet. Tilsett cefotaksim og ticarcillindinatrium til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 100 - 200 mg / l og 100 - 500 mg / l. Tilsett om nødvendig passende antibiotika (resistens skyldes T-DNA fra en binær vektor).
- Forbered 1 liter sammensatt plantevekstmedium ved å blande 2,2 g MS + B5 vitaminpulver, 10 g sukrose (1%) og 0,5 g MES-salter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH og overfør oppløsningen til en 1 l flaske. Tilsett 6 g geleringsmiddel (0,6%) og autoklav mediet. Tilsett cefotaksim og ticarcillindinatrium til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 200 mg/l og 500 mg/l. Tilsett om nødvendig passende antibiotika (resistens skyldes T-DNA fra en binær vektor).
- Forbered 1 liter regenereringsmedium ved å blande 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 30 g sukrose (3%) og 0,5 g MES-salter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør oppløsningen til en 1 l flaske og tilsett 3 g geleringsmiddel (0,3 %). Autoklav mediet. Tilsett NAA og BAP til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 8 mg/l og 5 mg/l, og ticarcillindinatrium til en endelig konsentrasjon på 100 mg/l.
- Forbered 1 l skuddforlengelsesmedium ved å blande 4,4 g MS + B5 vitaminpulver, 20 g sukrose (2%) og 0,5 g MES-salter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør løsningen til en 1 l flaske og tilsett 3 g planteagar (0,3%). Autoklav mediet. Tilsett BAP og GA3 til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 0,5 mg/l og 0,03 mg/l, og cefotaksim til en endelig konsentrasjon på 100 mg/l.
- Forbered 1 liter rotinduksjonsmedium ved å blande 2,2 g MS + B5 vitaminpulver, 10 g sukrose (1%) og 0,5 g MES-salter i dobbeltdestillert vann. Juster volumet til 1 L, bland og juster pH til 5,8 med KOH. Overfør oppløsningen til en 1 l flaske og tilsett 3 g geleringsmiddel (0,3%). Autoklav mediet. Tilsett IBA og cefotaksim til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 0,5 mg/l og 100 mg/l.
- Klargjør 1 l cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) buffer ved å tilsette 20 g CTAB (2 % w/v finale), 100 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM final), 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (20 mM finale), 81,8 g NaCl (1,4 m final) og 5 g PVP40 (0,5 % w/v final). Juster til 1 L med dobbelt destillert vann. Autoklav løsningen. Oppbevar løsningen i opptil 1 år ved romtemperatur.
2. Transformasjon av Agrobacterium med en binær vektor
- Forbered DNA fra et verifisert binært plasmid som inneholder T-DNA-kassetten som skal integreres i plantegenomet. Sørg for at plasmid-DNA inneholder lave salter for å unngå elektriske gnister når elektroporering brukes. Det anbefales å bruke et plasmid-DNA-ekstraksjonssett av valg.
- Klargjør elektrokompetente Agrobacterium tumefaciens C58C1-celler som inneholder det hårrotfremkallende plasmidet pRiA4b ved å inokulere 200 ml væske forvarmet (28 °C) YEB med 8 ml fersk kultur over natten. Inkuber dyrkning ved 28 °C under risting til den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) er ca. 0,5, tilsvarende midtloggfasen. Det tar ca 4 - 5 timer.
- Del Agrobacterium-kulturen i fire forkjølte sterile 50 ml sentrifugerør. Sentrifuge i 15 minutter ved 4 °C ved 3 200 x g.
MERK: Cellene skal holdes kalde fra dette trinnet og fremover. - Fjern supernatanten og resuspender pelleten forsiktig i (4x) 2,5 ml kald (4 °C) 10% glyserol. Tilsett ytterligere 47,5 ml kald 10% glyserol og bland forsiktig.
- Pelletsceller ved 3 200 x g i 15 minutter ved 4 °C. Kast supernatant og resuspendere celler i (4x) 10 ml kald 10% glyserol.
- Pellet cellene igjen og resuspender dem i (4x) 0,75 ml kald 10% glyserol. Samle innholdet i alle fire tubene i ett (totalvolum = 3 ml).
- Del den agrobakterielle løsningen i 50 μL alikoter i forkjølte sterile 1,5 ml mikrorør. Frys alikotene på tørris eller flytende nitrogen. Oppbevar tubene ved -80 °C for fremtidig bruk.
- Legg ett rør med kompetente celler (50 μL) på is, bland med 5 μL plasmid-DNA (1 μg totalt, fra trinn 2.1), overfør blandingen til en elektroporasjonskyvette (0,2 cm gap) og inkuber i 5 minutter på is.
- Plasser kyvetten i elektroporatoren og elektroporer cellene med følgende innstillinger: kapasitans 25 μFD, motstand 400 Ω, elektrisk spenning 2,5 kV, pulsvarighet 9,7 ms.
- Tilsett 950 μL LB flytende medium til cellene, som deretter dyrkes ved 28 ° C i 2 timer ved 300 o / min i en termomixer. Plate 50 μL av cellekulturen på et fast LB-medium med passende selektivt antibiotika. Dyrk platene i 2 dager ved 28 °C.
MERK: Det anbefales å plate en rekke cellekulturer (10 μL - 100 μL) per plate for å bestemme et riktig kulturvolum og unngå overvekst av bakterier. - Forbered flytende kulturer fra noen få utvalgte kolonier i 5 ml LB flytende medium med antibiotika. Dyrk bakteriene over natten ved 28 °C med risting. Bruk disse kulturene for glyserollagre ved å blande 0,5 ml flytende bakteriekultur og 0,5 ml 40% glyserol.
MERK: Disse koloniene er verifisert for tilstedeværelsen av transgenet ved koloni-PCR. For dette formålet, tilsett en liten mengde av en koloni fra en plate til PCR-masterblandingen som inneholder buffer, dNTP og Taq-polymerase etter eget valg, sammen med primere som forsterker en del av T-DNA fra en binær vektor. Inokulum fra glyserollagrene brukes til transformasjon av plantene.
3. Hårete rottransformasjon av Brassica napus DH12075
- Plasser frø av Brassica napus DH12075 i mikrorør og steriliser dem i en flytboks. Avfett først frøene med vann og 0,1% vaskemiddel mens du rister i 60 s. Skyll deretter frøene med vann etterfulgt av 70% etanol, begge i 60 s.
- Steriliser frøene ved hjelp av en 10% løsning av kommersielt blekemiddel som inneholder natriumhypokloritt. Rist frøene i denne løsningen i 20 minutter.
- Vask frøene 4x med sterilt vann i 60 s hver. Legg dem på petriskåler som inneholder frøspiringsmediet. Kaldstratifiser frøene ved 4 °C over natten og flytt platene til et dyrkingsrom (21 °C, 16 t lys / 8 t mørkt).
- Overfør 5 dager gamle frøplanter til plantekulturbokser som inneholder et plantevekstmedium .
MERK: Den beste transformasjonseffektiviteten i DH12075 ble identifisert for 18 dager gamle frøplanter. Frøplantealderen kan optimaliseres for de lokale vekstforholdene eller andre kultivarer. - Inokulere en væskekultur av Agrobacterium tumefaciens C58C1 som bærer et hårete rotinduserende plasmid pRiA4b og den binære vektoren for transformasjon (fra trinn 2.11) med en inokulasjonssløyfe. Bruk 5 ml LB-medium. Dyrk denne kulturen over natten ved 28 ° C til den når OD600 = 0,9 - 1.
MERK: Agrobacterium som bare inneholder Ri-plasmidet, brukes hvis hårete røtter av villtype produseres. - Injiser en liten mengde kultur (ca. 50 μL) med en insulinsprøyte i hypokotyl av en 18 dager gammel frøplante (fra trinn 3.4.). Punkter hypokotylen med en 26G kanyle montert på sprøyten ca. 1 cm over overflaten av mediet. Injiser væsken inn i såret. Vevet på overflaten av hypokotyl kan også ripes av sprøyten.
MERK: Antall inokulerte frøplanter må tilpasses eksperimentørens behov. - Sett plantene tilbake i dyrkingsrommet ved 21 °C i 2 til 4 uker til det dannes kallus og hårete røtter på sårstedet.
- Klipp av callus med de oppståtte hårete røttene fra hypocotyl og legg den på en petriskål med det hårete rotvekstmediet som inneholder selektive antibiotika (båret av T-DNA) og cefotaxim (200 mg / L) og ticarcillin (500 mg / L) for å undertrykke agrobakteriell vekst. Forsegl petriskålene med gassgjennomtrengelig tape. Dyrk de hårete røttene ved 24 °C i mørket.
MERK: Riktig konsentrasjon av spesifikke antibiotika som brukes til funksjonell seleksjon må testes med hårete røtter av vill type. For B. napus DH12075 hårete røtter som bærer motstand mot kanamycin, brukes en konsentrasjon på 25 mg / L kanamycin.
MERK: I dette trinnet er det mulig å generere en sammensatt plante bestående av villtypeskudd og transgene hårete røtter som støtter veksten av en slik plante. I stedet for å kutte av de hårete røttene fra en stamme, fjernes plantens innfødte røtter. Planten med nye hårete røtter overføres til en plantekulturboks med et sammensatt plantevekstmedium som inneholder cefotaksim (200 mg / L) og ticarcillin (500 mg / L) for å undertrykke agrobakteriell vekst, og det selektive antibiotika (båret av T-DNA). - Etter 1 - 2 uker, isoler de hårete røttene på petriskålen fra callus og individualiser dem på plater med samme kulturmedium. Overfør kulturen til en ny tallerken hver 4. til 5. uke. Tilsett 0,25 mg / l IBA for å øke rotforgreningen.
- Reduser konsentrasjonene av cefotaksim og ticarcillin gradvis ved hver overføring med 100 mg/l (dvs. mediet for den første overføringen inneholder 100 mg/l cefotaksim og 400 mg/l ticarcillin, for den andre overføringen, 300 mg/l ticarcillin osv.). Etter 3 - 4 måneder dyrker du de hårete røttene på et hårete rotvekstmedium med 100 mg/L ticarcillin og det selektive antibiotikumet.
4. Regenerering av Brassica napus DH12075 hårete røtter
- Overfør uavhengige hårete rotlinjer til plater med regenereringsmedium i sterile forhold ved hjelp av pinsett, flammet før bruk. Overfør 5 - 10 røtter per petriskål og dyrk dem ved 21 ° C i en lang dag fotoperiode (16 t lys / 8 h mørk). Forsegl petriskålene med gassgjennomtrengelig tape.
- Hver 3 til 4 uker, overfør de hårete røttene til plater med friskt regenereringsmedium. Legg merke til at calli dannes etter ca. 2 uker. Callus begynner å skyte etter 2 uker til til 8 - 9 uker etter kallusdannelse.
- Individualiser skuddene og overfør dem til plantekulturbokser med skuddforlengelsesmedium i 2 til 3 uker for å fremme forlengelsen av skuddene.
- Overfør de langstrakte skuddene til plantekulturbokser med et rotinduksjonsmedium. Oppdater kulturen hver 3 - 4 uker. Forankringseffektiviteten i DH12075 er 87% etter 30 dager og opptil 100% etter 60 dager.
- Overfør de rotte plantene til jorden etter å ha fjernet spor av geleringsmiddel for å forhindre soppinfeksjon. Sørg for at plantene først akklimatiseres i fytotronene (21 °C, langdagsfotoperiode, 150 μE) og overfør dem deretter til et drivhus for blomstring (21 °C / 18 °C, langdagsfotoperiode, 150 μØ).
5. Regenerant og T1 plantevalg
MERK: De hårete rotlinjene kan velges før du går inn i regenereringsprosessen. Typen av utvalg avhenger av innholdet som bæres av transgenet. De hårete røttene kan samples for DNA-ekstraksjon og genotyping eller mutasjonsdeteksjon, RNA-ekstraksjon med påfølgende cDNA-syntese og RT-qPCR for ekspresjonsnivåanalyse av det valgte genet, mikroskopi for fluorescensdeteksjon, eller behandles for GUS-farging.
- Etter overføring til jord, genotype T0 regenerant planter (og T1 frøplanter) igjen for å unngå rømming fra seleksjonsprosedyrene. T0-planter utviser en endret fenotype kalt Ri-fenotype: omfattende rotvekst, krøllete blader og dvergskudd forårsaket av tilstedeværelsen av TL og / eller TR-DNA av Ri-plasmidet satt inn i plantegenomet.
- For å øke hastigheten på T1-valget, bruk frøene som inneholder grønne, modne embryoer (ca. 21 - 28 dager etter pollinering for DH12075 for et torpedoembryo eller eldre) fra T0 regenerantplanter for embryoredning.
- Arbeid i den sterile flytboksen. Samle silikatene og overflatesteriliser dem med 70% etanol.
- Plasser dem på et dobbeltsidig tape tapet på et tallerkenlokk eller et lysbilde.
- Bruk en stereokikkert til å skjære silique langs ventilmarginene med en 26G nål. Sørg for at kuttet ikke skader frøene. For enkelt grep, monter kanylen på en 1 ml sprøyte.
- Åpne karpene og fest dem til båndet. Samle de umodne frøene og overfør dem til plater med medium for frøspredning. Forsegl platene med gassgjennomtrengelig tape.
- Legg platene i et dyrkingsrom (21 °C, 16 t lys / 8 t mørkt) til spiring.
- Genotype T1-plantene for tilstedeværelse av transgenet av interesse og fravær av Ri TR / TL (figur 1). Samle bladmateriale og trekke ut deres DNA ved hjelp av den valgte metoden. CTAB-metoden er beskrevet her:
- Samle bladmaterialet i et 2 ml mikrorør som inneholder to keramiske perler. Frys røret i flytende nitrogen.
- Slip materialet ved hjelp av en kulmølle. Alternativt kan pistol og mørtel benyttes.
- Etter en rask sentrifugering, tilsett 400 μL CTAB-buffer til pulveret. Virvel kort, sentrifuger, og rug ved 60 °C i minst 50 minutter.
- Avkjøl oppløsningen til romtemperatur i 15 minutter. Tilsett ett volum kloroform og bland forsiktig.
FORSIKTIG: Når du bruker kloroform, arbeid under kjemisk strømning og bruk hansker for beskyttelse. Oppløsning som inneholder kloroform skal kastes i egnet avfallsbeholder. - Sentrifuge i 5 min ved 18 400 x g ved bruk av en bordplatesentrifuge. Overfør 250 - 350 μL av den øvre vandige fase til et nytt mikrorør. Utelat interfasen.
- Tilsett ett volum isopropanol, bland godt og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Sentrifuge i 40 min ved 18 400 x g.
- Kast væsken og tilsett 200 μL 70% etanol. Vask pelleten og sentrifugen i 15 min ved 18 400 x g.
- Kast væsken. Lufttørk pelleten og tilsett 50 - 100 μL ultrarent vann. La DNA oppløses i 1 time til over natten i kjøleskapet.
- Utfør en genotyping ved PCR for rolA-genet (TL), aux1-genet (TR) og virC-lokuset (Agrobacterium). Forbered PCR-reaksjonen ved hjelp av det preparerte DNA (fra trinn 5.3.), primere, buffer, dNTP og Taq-polymerase i henhold til produsentens protokoll. De forsterkede fragmentene er 200 - 500 bp lange.
Primere spesifikke for rolA:
Fremover: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
Bakside: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
Primere spesifikt for aux1:
Fremover: CATAGGATCGCCTCAGGT
Omvendt: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
Primere spesifikt for virC:
Fremover: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
Bakside: AAACCGACCACTAACGCGAT
MERK: T-DNA-overføring og integrasjon kan være delvis, og bare deler av TL og / eller TR kan integreres i genomet. Det anbefales derfor å analysere tilstedeværelsen av andre ORFer av TL (f.eks. rolB og rolC) og TR (aux2, mas1, ags1) i T1-frøplanter. Primersekvenser som er spesifikke for disse stedene er oppført i Jedličková et al.9. - Evaluer PCR-reaksjoner ved gelelektroforese.
MERK: Det anbefales å inkludere en positiv kontroll i denne analysen for å sikre at du har PCR-grad DNA. - Velg for tilstedeværelse (eller fravær) av transgenet i henhold til protokollene basert på innholdet i dette transgenet.
- Overfør utvalgte frøplanter til jorden.
6. Hårete rottransformasjon og regenerering i Arabidopsis thaliana Col-0
- Overflatesteriliser A. thaliana frø med en valgfri metode (blekemiddel, etanol eller klorgass).
- Plate sterile frø på et medium for frøspredning. Etter 2 dager med kald lagdeling, flytt platene til et dyrkingsrom (21 °C med lang dagsfotoperiode og 50 % fuktighet).
- Overfør 1 uke gamle frøplanter til en plantekulturboks med plantevekstmedium.
- Forbered Agrobacterium-kulturer som angitt i trinn 3.5.
- Injiser en liten mengde kultur (ca. 50 μL) med en nål montert på en insulinsprøyte ved foten av den primære blomsterstandsstammen (ca. 1 - 2 cm over rosetten) av 1 måned gamle Arabidopsis-plantetter . Vevet på overflaten av primærstammen kan også ripes av sprøyten.
- På 2-4 uker etter injeksjonen, excise de nye hårete røttene og dyrke dem på petriskåler med hårete rotvekst medium supplert med selektiv antibiotika (båret av T-DNA) og cefotaxim (200 mg / L) og ticarcillin (500 mg / L) for å undertrykke agrobakteriell vekst. Inkuber platene ved 24 °C i mørket.
- Etter 1 - 2 uker, individualiser de hårete røttene på plater med samme kulturmedium. Overfør de valgte hårete rotlinjene til et friskt medium hver 4. - 5. uke.
MERK: A. thaliana hårete røtter er tynnere enn B. napus, og forsiktighet må utvises ved overføring til ferske medier. - Overfør de hårete røttene til plater med regenereringsmedium for å indusere kallusdannelse. Dyrk platene ved 21 °C i en fotoperiode over lang dag (16 timer lys / 8 timer mørk).
- Skudd kommer fra callus etter 18-21 dager med dyrking. Klipp skuddene og overfør dem til et skuddforlengelsesmedium i 2 - 3 uker for å fremme vekst og forlengelse.
- Overfør de langstrakte skuddene til rotinduksjonsmediet.
- Overfør de rotte plantene til jorden. T0-planter presenterer også en Ri-fenotype. Utfør den transgene seleksjonen, som beskrevet for B. napus DH12075 (trinn 5).
Representative Results
Vi har tidligere optimalisert en protokoll for injeksjonsbasert hårrotinduksjon i tre kultivarer av Brassica napus, nemlig DH12075, Topas DH4079 og Westar9. For å anvende denne transformasjonsprotokollen på modellarten A. thaliana, ble de primære blomsterstandsstammene til 1 måned gamle plantetter injisert med et agrobakterielt inokulum. Hårete røtter dukket opp på injeksjonsstedet etter 2-4 uker. Hårete røtter ble skåret ut og dyrket på det faste medium. Sammenligningen av metoden i disse to artene er vist i figur 1.
Utvalgte hårete rotlinjer ble overført til regenereringsmediet for å indusere skudddannelse. I A. thaliana ble gul calli indusert innen 14 dager i alle 10 testede hårete rotlinjer. Første skudd primordia synlig som mørkegrønne flekker dukket opp innen 3 uker etter overføring til regenereringsmediet (figur 2). Etter 4 ukers kultur dekket skuddene de hårete røttene i 9 av 10 hårete rotlinjer (90% regenereringseffektivitet). I noen tilfeller ble utilsiktede røtter fremkalt fra callus (figur 2H). En linje regenererte ikke selv etter 3 måneder på regenereringsmediet (hver 4. uke ble de hårete røttene overført til et friskt medium). Dermed ligner regenereringseffektiviteten til A. thaliana hårete røtter effektiviteten til B. napus DH120759.
Hårete rotregeneranter av B. napus og A. thaliana viser en dvergfenotype (figur 3), et typisk trekk ved de hårete rotavledede plantene2. Vi observerte også tette rotsystemer, rynkete blader og endringer i blomstringstid. Denne såkalte hårete rot (eller Ri) fenotypen er forårsaket av rolgenene fra Ri-plasmidet satt inn i plantegenomet. Innsettingen av Ri T-DNA og transgenet kodet på en binær vektor kan være uavhengig eller koblet. Dermed bidrar en segregeringsanalyse av T1-avkom skapt av selvbestøvning til å identifisere rolfrie planter som uttrykker transgenet av interesse. Genotyping av T1-plantene utføres av PCR-primere som er spesifikke for ORFene til TL og TR og transgenet av interesse. Fraværet av agrobakteriell kontaminasjon bekreftes ved fravær av PCR-produkter fra virC-primere (figur 1).
Figur 1 Sammendrag av prosedyren i A. thaliana og B. napus. Injeksjonen av Agrobacterium inoculum i hypocotyl eller primær blomsterstandstammen induserer utviklingen av hårete røtter. De hårete røttene kan erstatte de innfødte røttene for å generere en sammensatt plante som vil bli genotypet og analysert (blå piler). Kultiverte hårete røtter kan regenereres til T0-planter, forplantes i T1-planter og genotypes (grønne piler). De hårete røttene kan også subkultureres for funksjonell analyse (svart pil). Eksempler på genotypingsresultater presenteres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Regenerering av hårete røtter i A. thaliana. (A) Hårete rotkultur 1 dag etter overføring til plater. (B, C) Calli utviklet seg innen 2 uker med kultur på regenereringsmedium. (D, E) Skyt primordia dukket opp etter 3 uker med kultur. (G, H) Skudd dannes etter 4 uker. (H) Utilsiktede røtter utviklet fra callus. (C, F, I) Ikke-regenererende hårete rotlinje. Skalastenger representerer 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av B. napus og A. thaliana villtypeplanter og hårrotavledede regeneranter (T0-planter). Legg merke til Ri-fenotypen til regenerantene. Skalastenger representerer 2 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vi utviklet en enkel protokoll for hårete rottransformasjon og påfølgende regenerering i B. napus og A. thaliana. Denne prosessen inkluderer injeksjonsbasert hårrotinduksjon i hypocotyl (B. napus) eller primær blomsterstandsstamme (A. thaliana). Metoden for å injisere hypocotyl med agrobakteriestamme C58C1 som bærer et Ri-plasmid var også effektiv i Fabaceae-familien 10,11, foruten medlemmene av Brassicaceae presentert i denne studien.
Et alternativ til den injeksjonsbaserte metoden er nedsenkningsbasert transformasjon bestående av nedsenking i bakteriell suspensjon, etterfulgt av samdyrking av eksplanten med agrobakterier. Fordelen med den injeksjonsbaserte metoden fremfor nedsenkingsmetoden er tiden spart ved fravær av noen protokolltrinn: eksplantepreparasjon, en test av samdyrkingstiden og kultur på et medium som inneholder hormon for induksjon av hårete røtter. Selv om begge tilnærmingene er effektive for hårete rotinduksjon, ble det observert høyere transformasjonseffektivitet hos noen arter med den injeksjonsbaserte metoden sammenlignet med explant nedsenking en12,13. Videre er injeksjonsbasert transformasjon også nyttig for å generere komposittplanter (transgene hårete røtter og skudd av vill type). Etter å ha kuttet av de opprinnelige røttene til den transformerte planten, støtter hårete røtter planteveksten, og transgenet kan studeres i sammenheng med hele planten.
Det kritiske trinnet med hårete rotinduksjon er å injisere inokulumet i hypocotyl, eller primær blomsterstandstamme. Hypokotylene til B. napus er knuselige, og kutting av hele hypokotylen kan lett skje. Det samme kan observeres med A. thaliana på grunn av blomsterstandstammens tynnhet. Hvis en sammenligning av transformasjonseffektiviteten til forskjellige arter / kultivarer er nødvendig, anbefaler vi at en person utfører alle eksperimenter for å unngå feilen forårsaket av manipulasjon og dyktighet i å injisere plantene.
Vi utviklet en effektiv protokoll for hårete rotregenerering i B. napus DH12075 og A. thaliana Col-0. Siden regenerering er en svært variabel prosess, kan noen protokollendringer brukes på en art eller kultivar av valg. For eksempel kan de hårete rotavledede skuddene fremkalles av et annet auxin/cytokinin-forhold (1:1) i B. oleracea14. Alternativt kan cytokinin tidiazuron brukes i stedet for BAP, slik som for B. campestris hårete røtter15.
Flere innsettinger av Ri-plasmid T-DNA i plantegenomet representerer en potensiell begrensning av det hårete rottransformasjons- og regenereringssystemet. I slike tilfeller avdekkes ingen planter uten TL/TR fra Ri-plasmidet etter en segregeringsanalyse av T1-frøplanter. Derfor anbefaler vi å generere flere uavhengige hårete rotlinjer for hvert transgen.
Hårete rotkulturer er et ekstremt kraftig verktøy for genfunksjonelle studier, hovedsakelig på grunn av deres raske etablering og billig vedlikehold (ingen hormoner som trengs i dyrkingsmedier). Denne protokollen dekker metodene for hårete rotinduksjon og regenerering i B. napus og A. thaliana, som kan brukes til å studere transgenet av interesse direkte i hårete rotkulturer, i sammenheng med hele planten ved hjelp av sammensatte planter, eller etter regenerering av transgene planter.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført uten kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Jiří Macas (Biology Centre CAS, České Budějovice, Tsjekkia) for å gi den agrobakterielle stammen. Core Facility Plants Sciences av CEITEC MU er anerkjent for sin tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av departementet for utdanning, ungdom og idrett i Tsjekkia med Det europeiske regionale utviklingsfondets prosjekt "SINGING PLANT" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) og INTER-COST-prosjektet LTC20004.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
| 10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
| 1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
| 3M micropore tape | Micropore | ||
| 6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
| 70% ethanol | |||
| bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
| Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
| Bottles | DURAN | L300025 | |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| chloroform | Serva | 3955301 | |
| CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
| EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
| elctroporation cuvette | |||
| electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
| electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
| electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
| electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
| ethidium bromide | AppliChem | ||
| Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
| Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
| Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
| glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
| indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
| kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
| Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
| Measuring cylinder | |||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
| Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
| needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm | Terumo | ||
| pH meter | |||
| Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
| PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
| Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
| Retsh mill | Qiagen | ||
| sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
| square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
| sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
| Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
| thermomixer | Eppendorf | ||
| Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
| ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
| Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |
References
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Christey, M. C. Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Petit, A., et al. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).
- Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. Crop improvement. , Springer. Boston, MA. (2013).
- Jedličková, V., et al. Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus). Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).
- Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).
- Neumann, P., et al. Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species. Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).
- Montazeri, M., et al. A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum. Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).
- Zhang, X., et al. Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response. Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation. Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).
- Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).
