살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 동적 당염색체 pH 변화 측정
Summary
우리는 아프리카 트리파노솜의 혈류 형태의 글리코솜에서 pH가 환경 신호에 어떻게 반응하는지 연구하는 방법을 설명합니다. 이 접근법에는 pH 민감성 유전성 단백질 센서와 유세포 분석이 결합되어 시간 경과 분석 및 고처리량 스크리닝 형식으로 pH 역학을 측정하는 것이 포함됩니다.
Abstract
포도당 대사는 아프리카 트리파노솜인 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)에 중요한 역할을 하며, 이는 기생충 발달의 필수 대사 과정이자 조절자입니다. 환경 포도당 수치가 변할 때 생성되는 세포 반응에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 혈류와 순환 형태(곤충 단계) 기생충 모두에서 글리코솜은 해당과정의 대부분을 수용합니다. 이러한 세포 기관은 포도당 결핍에 대한 반응으로 빠르게 산성화되며, 이는 헥소키나아제(hexokinase)와 같은 해당효소(glycolytic enzyme)의 알로스테릭 조절(allosteric regulation)을 초래할 수 있습니다. 이전 연구에서는 pH 측정에 사용되는 화학 프로브의 위치를 파악하는 것이 어려웠기 때문에 다른 Application에서의 유용성이 제한되었습니다.
이 논문은 유전성 단백질 pH 바이오센서인 글리코솜 국소화 pHluorin2를 발현하는 기생충의 개발 및 사용에 대해 설명합니다. pHluorin2는 395nm에서 pH(산)에 따른 여기(excitation) 감소를 나타내는 동시에 475nm에서 여기(excitation)를 증가시키는 비율계량 pHluorin 변형체입니다. 형질전환 기생충은 pHluorin2 open reading frame을 트리파노솜 발현 벡터 pLEW100v5로 클로닝하여 생성되었으며, 두 수명 주기 단계에서 유도 가능한 단백질 발현을 가능하게 했습니다. 면역형광을 사용하여 pHluorin2 바이오센서의 글리코솜 국소화를 확인하고, 바이오센서의 국소화를 글리코솜 상주 단백질 알돌라아제와 비교하였다. 센서 응답성은 pH 4에서 8 사이의 일련의 완충액에서 세포를 배양하여 다양한 pH 수준에서 보정되었으며, 이는 이전에 플루오레세인 기반 pH 센서를 보정하는 데 사용한 접근 방식입니다. 그런 다음 글리코솜 pH를 측정하기 위해 유세포 분석을 사용하여 405nm 및 488nm에서 pHluorin2 형광을 측정했습니다. 우리는 PF 기생충에서 글리코솜 산성화의 알려진 원인인 포도당 결핍에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 pH를 모니터링하여 살아있는 형질전환 pHluorin2 발현 기생충의 성능을 검증했습니다. 이 도구는 고처리량 약물 스크리닝에 잠재적으로 사용되는 것을 포함하여 다양한 잠재적 응용 분야를 가지고 있습니다. 글리코솜 pH 외에도 센서를 다른 소기관에 적용하거나 다른 트리파노소마티드에 사용하여 살아있는 세포 환경에서 pH 역학을 이해할 수 있습니다.
Introduction
대부분의 살아있는 유기체와 마찬가지로 기생 키네토플라스티드는 중앙 탄소 대사의 기본 구성 요소로 포도당에 의존합니다. 이 그룹에는 아프리카 트리파노솜, Trypanosoma brucei와 같은 의학적으로 중요한 유기체가 포함됩니다.미국 트리파노솜, T. cruzi; 그리고 Leishmania 속의 기생충. 포도당 대사는 병원성 수명 주기 단계에서 기생충 성장에 매우 중요합니다. 예를 들어, 포도당이 결핍되면 아프리카 트리파노솜의 혈류 형태(BSF)가 빠르게 죽습니다. 특히, 해당과정(glycolysis)은 이 감염 단계에서 ATP의 유일한 공급원 역할을 한다1. 리슈마니아 기생충도 마찬가지로 인간 숙주의 포도당에 의존하며, 숙주 대식세포에 상주하는 아마스티고테 수명 주기 단계는 성장을 위해 이 탄소원에 의존한다2.
이 기생충은 다양한 곤충 매개체와 관련된 독특한 생활 방식을 가지고 있지만 포도당에 반응하고 섭취하는 방식에서 많은 공통점을 공유합니다. 예를 들어, 이러한 기생충은 대부분의 해당작용 효소를 글리코솜이라고 하는 변형된 과산화소체로 국소화합니다. 이 키네토플라스티드 특이적 세포소기관은 보존된 생합성 메커니즘 및 형태 3,4,5,6을 기반으로 하는 포유류 과산화소체와 관련이 있습니다.
대부분의 해당과정 효소를 당염색체로 구획화하면 기생충 특이적 경로 조절 수단이 제공됩니다. 화학적 pH 프로브를 사용하여 영양 결핍이 프로사이클릭 형태(PF) 기생충 글리코좀의 급격한 산성화를 유발하여 주요 해당효소 헥소키나제 7,8에 대한 알로스테릭 조절자 결합 부위의 노출을 통해 해당효소 활성을 변화시킨다는 것을 확인했습니다. 이전 연구에서 화학 프로브는 사용을 위해 지속적인 전달이 필요했기 때문에 다른 응용 분야에서의 유용성이 제한되었습니다. 또한 BSF의 당체에서 프로브 분포를 유지하는 데 어려움이 있어 해당 수명 단계에서 당체 pH를 조사하기 위한 접근 방식의 유용성이 제한되었습니다.
이 연구에서는 형광 단백질 바이오센서 pHluorin2를 사용하여 포도당 결핍을 포함한 환경적 단서에 대한 반응으로 BSF T. brucei 의 당염색체 pH 변화를 모니터링했습니다9 (그림 1). 이 연구의 결과는 BSF T. brucei 가 PF 기생충에서 관찰된 반응과 유사한 가역적 방식으로 기아에 대한 반응으로 글리코솜을 빠르게 산성화한다는 것을 시사합니다. 우리는 이 바이오센서가 T. brucei 및 관련 기생충의 해당작용 조절에 대한 이해를 향상시킬 것으로 기대합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
아프리카 트리파노솜의 환경 인식과 반응 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 영양소 가용성의 변화는 글리코솜의 산성화를 포함하여 기생충의 다양한 반응을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 유전성 단백질 센서, pHluorin2 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포의 환경 섭동에 대한 글리코솜 pH 반응을 연구하는 방법을 설명했습니다.
센서 사용에는 몇 가?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1은 고-카피 클로닝 벡터에서 작제물을 제공한 Twist Bioscience에 의해 pLEW100v5로 클로닝되었습니다. pLEW100v5는 조지 크로스 박사의 선물이었습니다. T. brucei aldolase에 대해 제기된 항혈청은 요청 시 Clemson University의 Meredith T. Morris 박사로부터 구할 수 있습니다. JCM과 KAC 실험실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01AI156382)의 상에 의해 부분적으로 지원되었습니다. SSP는 NIH 3R01AI156382에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
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