Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo
Summary
Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.
Abstract
O metabolismo da glicose é crítico para o tripanossoma africano, Trypanosoma brucei, como um processo metabólico essencial e regulador do desenvolvimento do parasita. Pouco se sabe sobre as respostas celulares geradas quando os níveis de glicose ambiental se alteram. Tanto na corrente sanguínea quanto na forma pró-cíclica (estágio de inseto) parasitas, os glicossomas abrigam a maior parte da glicólise. Essas organelas são rapidamente acidificadas em resposta à privação de glicose, o que provavelmente resulta na regulação alostérica de enzimas glicolíticas como a hexoquinase. Em trabalhos anteriores, localizar a sonda química usada para fazer medições de pH foi um desafio, limitando sua utilidade em outras aplicações.
Este trabalho descreve o desenvolvimento e o uso de parasitas que expressam pHluorina glicossomicamente localizada2, um biossensor de pH de proteína hereditária. A pHluorina2 é uma variante ratiométrica da pHluorina que apresenta uma diminuição da excitação dependente do pH (ácido) a 395 nm, ao mesmo tempo que produz um aumento da excitação a 475 nm. Parasitas transgênicos foram gerados pela clonagem do quadro de leitura aberta pHluorin2 no vetor de expressão de tripanossomas pLEW100v5, permitindo a expressão de proteínas induzíveis em ambos os estágios do ciclo de vida. A imunofluorescência foi utilizada para confirmar a localização glicossomal do biossensor pHluorin2, comparando a localização do biossensor com a aldolase da proteína residente no glicossomo. A responsividade do sensor foi calibrada em diferentes níveis de pH incubando as células em uma série de tampões que variaram em pH de 4 a 8, uma abordagem que usamos anteriormente para calibrar um sensor de pH baseado em fluoresceína. Em seguida, medimos a fluorescência da pHluorina2 a 405 nm e 488 nm usando citometria de fluxo para determinar o pH glicossomal. Validamos o desempenho dos parasitas transgênicos vivos que expressam pHluorina2, monitorando o pH ao longo do tempo em resposta à privação de glicose, um conhecido gatilho da acidificação glicossomal em parasitas PF. Esta ferramenta tem uma gama de aplicações potenciais, incluindo potencialmente ser usada na triagem de drogas de alto rendimento. Além do pH glicossomal, o sensor pode ser adaptado a outras organelas ou usado em outros tripanosomatídeos para entender a dinâmica do pH no ambiente de células vivas.
Introduction
Os cinetoplastídeos parasitas, como a maioria dos organismos vivos, dependem da glicose como um componente fundamental do metabolismo central do carbono. Este grupo inclui organismos medicamente importantes, como o tripanossoma africano, Trypanosoma brucei; o tripanossoma americano, T. cruzi; e parasitas do gênero Leishmania. O metabolismo da glicose é crítico para o crescimento do parasita nos estágios do ciclo de vida patogênico. Por exemplo, quando privado de glicose, a forma sanguínea (BSF) do tripanossoma africano morre rapidamente. Notadamente, a glicólise serve como única fonte de ATP durante esse estágio da infecção1. Os parasitas de Leishmania também são dependentes de glicose no hospedeiro humano, sendo o estágio do ciclo de vida amastigota que reside nos macrófagos do hospedeiro dependente dessa fonte de carbono para o crescimento2.
Embora esses parasitas tenham estilos de vida distintos envolvendo diferentes insetos vetores, eles compartilham muitas semelhanças em como respondem e consomem glicose. Por exemplo, esses parasitas localizam a maioria das enzimas glicolíticas em peroxissomas modificados chamados glicossomas. Esta organela cinetoplastídica-específica está relacionada aos peroxissomas de mamíferos com base em mecanismos biossintéticos conservadose morfologia 3,4,5,6.
A compartimentalização da maioria das enzimas da via glicolítica no glicossoma oferece meios parasito-específicos de regulação da via. Usando uma sonda química de pH, estabelecemos que a privação de nutrientes desencadeia uma rápida acidificação dos glicossomas parasitas da forma pró-cíclica (PF) que resulta em alteração da atividade enzimática glicolítica através da exposição de um sítio de ligação do regulador alostérico na enzima glicolítica chave hexoquinase 7,8. Em nosso trabalho anterior, a sonda química exigia entrega constante para uso, limitando sua utilidade em outras aplicações. Além disso, desafios na manutenção da distribuição da sonda no glicossomo na BSF limitaram a utilidade da abordagem para a investigação do pH glicossomal nessa fase da vida.
Neste estudo, usamos o biossensor de proteína fluorescente pHluorin2 para monitorar a mudança de pH glicossomal em BSF T. brucei em resposta a pistas ambientais, incluindo a falta de glicose9 (Figura 1). Os resultados deste trabalho sugerem que o FSB T. brucei acidifica glicossomas rapidamente em resposta à inanição de forma reversível, semelhante às respostas que observamos em parasitas da FP. Esperamos que este biossensor melhore nossa compreensão da regulação glicolítica em T. brucei e parasitas relacionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A percepção ambiental e os mecanismos de resposta no tripanossoma africano são pouco compreendidos. Sabe-se que alterações na disponibilidade de nutrientes desencadeiam diversas respostas no parasita, incluindo acidificação de glicossomas. Aqui, descrevemos um método para estudar a resposta do pH glicossomal a perturbações ambientais em células vivas usando um sensor de proteína hereditária, pHluorin2, e citometria de fluxo.
Existem várias etapas críticas no uso do sensor. Prime…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 foi clonado em pLEW100v5 pela Twist Bioscience que forneceu a construção em um vetor de clonagem de alta cópia; pLEW100v5 foi um presente do Dr. George Cross. Antissoro levantado contra T. brucei aldolase está disponível na Dr. Meredith T. Morris, Clemson University, mediante solicitação. O trabalho dos laboratórios JCM e KAC foi parcialmente apoiado por um prêmio do National Institutes of Health (R01AI156382). O SSP foi suportado pelo NIH 3R01AI156382.
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
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