Summary
يوصف إجراء جراحي لإجراء الحقن في الخزان القطني للفئران الأحداث. وقد استخدم هذا النهج لتوصيل نواقل العلاج الجيني داخل القراب ، ولكن من المتوقع أن يمكن استخدام هذا النهج لمجموعة متنوعة من العلاجات ، بما في ذلك الخلايا والعقاقير.
Abstract
العلاج الجيني هو تقنية قوية لتوصيل جينات جديدة للمريض لعلاج المرض ، سواء كان ذلك لإدخال جين وظيفي ، أو تعطيل جين سام ، أو توفير جين يمكن لمنتجه تعديل بيولوجيا المرض. يمكن أن تتخذ طريقة توصيل الناقل العلاجي أشكالا عديدة ، تتراوح من التسريب في الوريد للتسليم الجهازي إلى الحقن المباشر في الأنسجة المستهدفة. بالنسبة للاضطرابات التنكسية العصبية ، غالبا ما يكون من المرغوب فيه تحريف التنبيغ نحو الدماغ و / أو الحبل الشوكي. يتضمن النهج الأقل توغلا لاستهداف الجهاز العصبي المركزي بأكمله الحقن في السائل النخاعي (CSF) ، مما يسمح للعلاج بالوصول إلى جزء كبير من الجهاز العصبي المركزي. الطريقة الأكثر أمانا لتوصيل ناقل إلى السائل الدماغي الشوكي هي الحقن داخل القراب القطني ، حيث يتم إدخال إبرة في الخزان القطني للحبل الشوكي. هذه التقنية ، المعروفة أيضا باسم البزل القطني ، تستخدم على نطاق واسع في القوارض حديثي الولادة والبالغين وفي النماذج الحيوانية الكبيرة. في حين أن هذه التقنية متشابهة عبر الأنواع ومراحل النمو ، فإن الاختلافات الدقيقة في حجم وهيكل ومرونة الأنسجة المحيطة بالفضاء داخل القراب تتطلب تسهيلات في النهج. توضح هذه المقالة طريقة لإجراء البزل القطني في الفئران اليافعة لتوصيل ناقل النمط المصلي 9 المرتبط بالغدي. هنا ، تم حقن 25-35 ميكرولتر من النواقل في الصهريج القطني ، وتم استخدام مراسل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتقييم ملف تعريف التنبيغ الناتج عن كل حقنة. وتناقش فوائد وتحديات هذا النهج.
Introduction
لقد تحقق أخيرا وعد العلاجات الجينية بوساطة فيروسية في السنوات الأخيرة بموافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على علاجات ضمور العضلات الشوكي وضمور الشبكية والعامل التاسع الهيموفيليا والسرطان والمزيد1،2،3،4. هناك عدد لا يحصى من العلاجات الأخرى قيد التطوير حاليا. يهدف العلاج الجيني إلى توصيل جين علاجي إلى خلايا المريض. يمكن أن تحل منتجات هذا الجين الجديد محل النشاط المفقود من جين داخلي ناقص ، أو تثبيط جين سام ، أو تقتل الخلايا السرطانية ، أو توفر بعض الوظائف المفيدة الأخرى.
بالنسبة للأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، غالبا ما يكون توصيل ناقل العلاج الجيني مباشرة إلى الأنسجة المستهدفة أمرا مرغوبا فيه. توفر النهج غير النظامية فائدتين: فهي تقلل من الآثار الجانبية غير المستهدفة التي قد تسببها عملية التنبيغ المحيطي ، وتقلل بشكل كبير من كمية الناقل اللازمة لتحقيق مستويات كافية من التنبيغ في الأنسجة المستهدفة5.
هناك مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيل نواقل العلاج الجيني إلى الجهاز العصبي المركزي. يمكن استخدام الحقن داخل اللحمة ، وهو حقن ناقل مباشرة في الحبل الشوكي أو أنسجة المخ ، للتوصيل إلى منطقة محددة. ومع ذلك ، بالنسبة للعديد من الأمراض ، من المرغوب فيه نقل واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق توصيل ناقل إلى السائل الدماغي الشوكي (CSF)5 ، وهو السائل الذي يتدفق داخل وحول الدماغ والحبل الشوكي. هناك ثلاث طرق أساسية لتوصيل المتجهات إلى السائل الدماغي الشوكي. النهج الأكثر توغلا هو الولادة داخل بطانة الرحم البطينية ، والتي تنطوي على حفر ثقب نتوء من خلال الجمجمة ودفع إبرة عبر الدماغ إلى البطينين الجانبيين. هذا ينتج عنه نقل في جميع أنحاء الدماغ. ومع ذلك ، قد يسبب الإجراء نزيفا داخل الجمجمة ، وينتج النهج عموما نقيضا محدودا فقط للحبل الشوكي6. الحقن في الصهريج الكبير في قاعدة الجمجمة أقل توغلا ، ولكنه ينطوي على خطر تلف جذع الدماغ. بينما يستخدم غالبا في الأبحاث على5 ، لم يعد الحقن في الصهريج ماجنا يستخدم بشكل روتيني في العيادة7. البزل القطني هو النهج الأقل توغلا للوصول إلى السائل الدماغي الشوكي. يتضمن ذلك وضع إبرة بين فقرتين قطنيتين وفي الصهريج القطني.
يتم إجراء البزل القطني لتوصيل النواقل بشكل روتيني في الجرذان والفئران البالغة وفي الفئران الوليدية 8,9. أجرى مؤلفو هذه الدراسة مؤخرا ثقوبا قطنية في الفئران اليافعة (28-30 يوما من العمر) لتوصيل ناقلات الفيروس من النمط المصلي 9 (AAV9) المرتبطة بالغدي. في الفئران البالغة ، تم وضع إبرة البزل القطني الوليدي عموديا بين الفقرات L3 و L49. ينتج عن الموضع المناسب نقرة الذيل وتدفق السائل الدماغي النخاعي إلى خزان الإبرة. في الفئران اليافعة ، على الرغم من ذلك ، لا يمكن تحقيق أي من هذه القرأات. ثم حاول المؤلفون تكييف إجراء فأر بالغ باستخدام حقنة أنسولين 27 جيجا يتم إدخالها بزاوية بين L5 و L610. في الفئران البالغة ، والتي عادة ما تكون أصغر من الفئران P28 ، لا ينتج عن ذلك نقرة ذيل ، ولكن وضع الإبرة غير الصحيح واضح من خلال التدفق العكسي للحقن. ومع ذلك ، في الفئران اليافعة ، أدى هذا النهج بشكل موحد إلى إعطاء الحقن فوق الجافية ، ومن المحتمل أن يكون ناتجا عن مرونة مختلفة بين الفئران البالغة والجرذان اليافعة لطبقات الأنسجة المحيطة بالحبل الشوكي. تم تقييم نهج القسطرة بعد ذلك. على وجه التحديد ، تم إدخال قسطرة من خلال شق في الجافية من الخزان القطني وحتى منتصف الحبل الشوكي الصدري. ومع ذلك ، أدى هذا النهج إلى ارتجاع كبير للحقن مرة أخرى من موقع الشق أثناء الولادة. كما باءت محاولات وضع القسطرة في الفضاء داخل القراب عن طريق الجلد باستخدام إبرة توجيه بالفشل. نظرا لضيق العرض بين الصفيحات ، من المحتمل أن تصطدم القسطرة بالصفيحة المنضدية وتفشل في التقدم.
هنا ، يتم وصف طريقة لتحقيق توصيل محلول ناجح وقابل للتكرار عن طريق البزل القطني في الفئران اليافعة. يمكن استخدام هذا النهج للنواقل الفيروسية ، وعلى الأرجح أيضا للخلايا والمستحضرات الصيدلانية والعلاجات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة إيموري (IACUC). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (28-30 يوما من العمر ، كتلة في حدود حوالي 90-135 جم ، ذكور وإناث) في هذه الدراسة.
1. إعداد المتجه
- قم بإذابة متجه AAV9 (انظر جدول المواد) على الجليد في بداية الإجراء.
- جهاز الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الناقل لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة لضمان وجود كل السائل في قاع الأنبوب.
- قم بنفض الغبار برفق عن أنبوب الطرد المركزي الدقيق للتأكد من خلط المحلول جيدا.
2. إعداد قفص الانتعاش
- ضع قفصا نظيفا على بطانية كهربائية (انظر جدول المواد) بحيث يكون نصف القفص فقط ملامسا للبطانية.
- اضبط درجة حرارة البطانية على ~ 37 °C.
3. إعداد المنصة الجراحية
- قم بتسخين ضمادة متساوية الحرارة (انظر جدول المواد) إلى 39 درجة مئوية في ميكروويف أو حمام مائي حتى تصبح المحتويات سائلة.
- ضع الوسادة متساوية الحرارة على المنصة الجراحية وقم بتغطيتها بوسادة مقعد ماصة نظيفة.
4. إعداد
- تخدير الفئران مع isoflurane في مربع واضح (بعد البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). ابدأ تحريض التخدير باستخدام 5٪ إيزوفلوران ، وتنحى بنسبة 1٪ في الدقيقة حتى تصل إلى 2٪. امسك بنسبة 2٪ لمدة 3 دقائق إضافية.
- حرك الصندوق الذي يحمل إلى غطاء دخان وافتح الصندوق.
ملاحظة: هذا يحد من تعرض الجراح للمخدر. - قم بإزالة الشعر من الجزء الخلفي من باستخدام ماكينات قص الشعر الكهربائية.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام كريم مزيل الشعر أو ماكينة حلاقة يدوية وكريم حلاقة. - ضع على المنصة الجراحية مع خطمه في مخروط أنف التخدير.
ملاحظة: قد يبدأ في استعادة وعيه أثناء إزالة الفراء من موقع الجراحة. إذا حدث هذا ، فقم بتخديره مرة أخرى كما هو موضح أعلاه. - ضع مرهم ترطيب العين على كل عين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية.
- تطهير المنطقة الجراحية باستخدام ثلاثة تطبيقات بالتناوب من مناديل بوفيدون اليود والأيزوبروبانول.
- حقن المسكن (المسكنات) تحت الجلد.
ملاحظة: يستخدم البوبرينورفين بشكل عام بجرعة 0.01-0.05 ملغم / كغم ، يعطى كل 12 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن إعطاء شكل بطيء الإطلاق من هذا الدواء مرة واحدة عند 1 مجم / كجم لتوفير السيطرة الكافية على الألم لمدة 72 ساعة. التشاور مع IACUC للمؤسسة للحصول على إرشاداتهم المتعلقة بإدارة الألم. - حقن 100 ميكرولتر من 1٪ يدوكائين تحت الجلد فوق العمليات الشائكة L2 إلى L6 لتوفير التخدير الموضعي.
- ضع لفة من منشفة ورقية أو أنبوب قطره 1.5 سم تحت ، فقط منبر إلى الوركين. هذا يساعد على ثني العمود الفقري ، مما يسهل إدخال الإبرة بين الصفيحتين.
- ضع ثنى مزخرفا (انظر جدول المواد) على ، مع توسيط الفتحة على العمود الفقري القطني.
5. تعريض العمود الفقري القطني
- تأكيد عمق التخدير عن طريق معسر كل من الكفوف والبحث عن عدم وجود استجابة الانسحاب.
- باستخدام شفرة مشرط # 11 ، قم بإنشاء شق بطول 3 سم تقريبا في الجلد أسفل خط الوسط من L2 إلى L6.
- قم بفك الجلد من العضلات عن طريق إدخال مقص جراحي منحني معقم بين العضلات والجلد ثم فتح الأطراف.
- قم بإزالة اللفافة التي تغطي العمليات الشائكة L2-L5.
6. تحميل المحقنة
- ماصة 25-35 ميكرولتر من الناقل (لتحقيق الجرعة المطلوبة) في غطاء أنبوب الطرد المركزي المجهري المعقمة.
- ارسم الحجم بالكامل في حقنة الأنسولين.
ملاحظة: احرص على عدم سحب الهواء أثناء هذه العملية.
7. إجراء الحقن
- تحديد العمليات الشائكة L5 و L4.
ملاحظة: يقع L6 مباشرة بين القمتين الحرقفيتين ، ويجب أن يكون من السهل التعرف على عمليته الشائكة عن طريق التحقيق باستخدام أداة حادة. يمكن بعد ذلك تشغيل الأداة برفق إلى الخلف للعثور على حدود عمليتي L5 و L4. - ضع يدا واحدة بحيث يستقر الإبهام برفق على ذيل وساق واحدة. استخدم إصبعك لتثبيت المحقنة.
- ضع إبرة المحقنة بحيث تكون على يسار العملية الشائكة L5 وتصطف مع نهايتها الذيلية. ضع المحقنة بحيث تكون حوالي 30 درجة من خط الوسط و 30 درجة لأعلى من مستوى الطاولة.
ملاحظة: قد يكون من المفيد استخدام المجهر الجراحي لتحديد المعالم بشكل أفضل ووضع طرف الإبرة. - ادفع إبرة المحقنة للأمام حوالي 8 مم ، فوق الجزء العلوي من الصفيحة L5 ثم تحت الصفيحة L4 في الخزان القطني حتى يتم ضرب العظم. سيؤدي الوضع الصحيح إلى ارتعاش في الساق و / أو الذيل يمكن رؤيته أو الشعور به من خلال وضع الإبهام على الساق / الذيل. إذا لم يكن هناك نشل ، فقم بإزالة الإبرة وحاول الإجراء من الجانب الأيسر. إذا لم يكن هناك نشل حتى الآن ، كرر الإجراء بين L4 / L3 و L3 / L2 حسب الضرورة.
- اضغط على المكبس ببطء لمدة 5 ثوان.
ملاحظة: قد يكون هناك ارتعاش في الساق أو الذيل أثناء الحقن. - ثبت المحقنة في مكانها لمدة 30 ثانية تقريبا بعد الضغط الكامل على المكبس للسماح للضغط بالتوازن وتقليل ارتجاع الحقن عند سحب الإبرة.
- قم بإزالة الإبرة ببطء.
8. إغلاق الشق
- تقريب حواف الشق.
- بدءا من أحد طرفي الجرح ، استخدم خياطة 4-0 (انظر جدول المواد) أو دبابيس جراحية لإغلاق الشق.
9. الانتعاش والمراقبة
- ضع في القفص المسخن.
- افحص كل 15 دقيقة على الأقل حتى يصبح متنقلا بالكامل.
ملاحظة: يجب أن يستغرق هذا ما بين 15 دقيقة و 45 دقيقة. - خلال الأيام الثلاثة التالية ، قم بإجراء فحوصات العافية يوميا على الأقل. توفير المسكنات لأول 2 أيام بعد الجراحة أو كما هو مطلوب من قبل IACUC.
- بعد أسبوع واحد من الجراحة ، قم بإزالة الغرز أو الدبابيس.
10. إجراءات المتابعة
ملاحظة: لتحديد دقة تقنية الحقن ، قم بحقن صبغة التريبان الزرقاء كما هو موضح أعلاه ثم القتل الرحيم للحيوان على الفور (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) وإجراء استئصال الصفيحة الفقرية لتصور النتيجة.
- بينما يبقى تحت التخدير ، يتم القتل الرحيم عن طريق إعطاء جرعة مميتة من بنتوباربيتال عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 150 مجم / كجم.
- بمجرد توقف التنفس ونشاط القلب ، افتح تجويف الصدر لضمان الموت. تمديد شق الجراحية حتى الظهر إلى الرقبة.
- قم بعمل شق بطول 4 سم في العضلات الموازية للعمود الفقري على جانبي العمليات الشائكة ، مع الحفاظ على أقرب ما يمكن من العمليات.
- باستخدام ملقط ناعم أو مقص ، قم بإزالة العضلات من بين العمليات الشائكة.
- قم بإزالة العمليات الشائكة من L6 حتى العمود الفقري الصدري السفلي باستخدام rongeur (انظر جدول المواد). تجنب حركات الالتواء ، لأن ذلك قد يتلف الرونجور.
- أدخل الطرف السفلي من rongeur تحت الصفيحة L5 وإزالة العظم الذي يغطي الحبل الشوكي عن طريق إخراج عدة "لدغات" منه.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي التراجع عن العملية الشائكة L6 إلى تسهيل إدخال طرف الرونجور. يجب توخي الحذر لمنع تلف الحبل الشوكي. - استمر في توسيع استئصال الصفيحة الفقرية على الأقل أربعة صفائح منبثقة . افحص السطح الداخلي للصفائح بحثا عن علامات الصبغة ، والتي يمكن أن تشير إلى فشل الحقن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد دقة تقنية الحقن ، تم استخدام صبغة ، تريبان بلو ، كبديل للعلاج. ترتبط هذه الصبغة بسهولة بالبروتينات ، لذلك تظل بشكل عام داخل الهيكل الذي تم حقنها فيه. هذا يعني أن الصبغة قد لا تتنبأ بدقة بتوزيع العلاج بعد الحقن. يتم استخدامه ببساطة للكشف عن دقة الحقن. عند إدخاله بنجاح في الصهريج القطني ، يرتبط التريبان الأزرق بالأم الجافية ، مما يؤدي إلى تلطيخ محيط الحبل الشوكي باللون الأزرق. ومع ذلك ، عندما تفشل الإبرة في اختراق الأم الجافية ، تنتهي الصبغة في الفضاء فوق الجافية. سيتم تلوين كل من الأم الجافية والأنسجة المحيطة بها (سطح العظم والأربطة والعضلات التي تربط الصفيحات) باللون الأزرق. هذه الأنماط مرئية بسهولة للعين المجردة.
من الصعب تقييم الفرق بين الحقن الذي يتم إعطاؤه بشكل صحيح وغير صحيح إذا قام المرء ببساطة بإجراء قطع عرضي عبر الحبل الشوكي والعمود الفقري. بدلا من ذلك ، يوصى بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية باستخدام زوج من الرونجور بدءا من الصفيحة L5 والتحرك بشكل منضدي. يجب الحرص على عدم إتلاف الأم الجافية في هذه العملية. استخدام المجهر تشريح يجعل هذه العملية أسهل. يقدم الشكل 1 أمثلة مقارنة للحقن الناجحة والحقن الناجحة جزئيا فقط. مع الحقن الناجح ، لوحظ القليل من الارتجاع على طول مسار الإبرة عند سحب الإبرة. بعد الحقن الناجح ، تكشف إزالة الصفيحة لكشف الحبل الشوكي عن اللون الأزرق داخل الحبل الشوكي ولكن ليس على سطح العظم (الشكل 1 أ). تظهر الصبغة أيضا على جذع الدماغ والمخيخ بعد الحقن الناجح (الشكل 1 ب). في المقابل ، يتضح الحقن الناجح جزئيا من خلال ارتداد كبير للصبغة احتياطيا في قناة الإبرة أثناء عملية الحقن و / أو دليل مرئي على وجود صبغة على العظم (الشكل 1 ج).
باستخدام الإجراء أعلاه ، تم حقن 28 ميكرولتر من ناقل AAV9 الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (GFP) بتركيز 3 × 1013 جينوم ناقل / مل ، لجرعة إجمالية قدرها 8.4 × 1011 جينومات ناقل /. بعد أربعة أسابيع ، تم القتل الرحيم للحيوانات وتعطيرها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد10. ثم تم حصاد الدماغ والحبل الشوكي وإعدادهما للتقسيم المجمد. تم الحصول على مقاطع بسمك 40 ميكرومتر وتلطيخها من أجل GFP. يقدم الشكل 2 أمثلة على نمط النقل الذي تم الحصول عليه باستخدام هذا المتجه. كان التنبيغ أعلى بشكل عام في الحبل الشوكي ، خاصة في منطقة أسفل الظهر (الشكل 2A-C) ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى قربه من موقع الحقن. تم تحقيق نقل الدماغ (الشكل 2D-F) ، ولكن ، كما هو متوقع ، كان يميل إلى أن يكون أكثر محدودية مما شوهد في الحبل الشوكي.
لتوضيح قابلية استنساخ النتائج التي حققها جراح واحد من ذوي الخبرة باستخدام مجموعة واحدة من الفيروسات ، يتم عرض الأجزاء الملطخة من المخيخ والقشرة من كل من الفئران ال 15 التي تم حقنها لهذه الدراسة في الشكل 3 والشكل 4 ، على التوالي. يتم أيضا عرض الأجزاء الملطخة من الحبل الشوكي العنقي ل 7 من هذه الفئران ال 15 (الشكل 5). بالطبع ، قد تظهر كمية نقل الدماغ تباينا أكبر مع الجرعات المختلفة ، والكثير من النواقل ، والجراحين10.
الشكل 1: تعرض الحبل الشوكي بعد حقن الصبغة. تم إجراء عمليات استئصال الصفيحة بعد حقن التريبان الأزرق. (أ) يكون الحبل الشوكي ملطخا باللون الأزرق في الحقن الذي يتم إعطاؤه بشكل صحيح، ولا تظهر صبغة على العظم الذي تمت إزالته أثناء استئصال الصفيحة الفقرية (الأسهم). (ب) يمكن أيضا ملاحظة الصبغة حول جذع الدماغ. (ج) في الحقنة التي حدث فيها ارتجاع كبير أثناء الحقن، تقل الصبغة داخل الحبل السري، وتوجد صبغة على سطح العظم (الأسهم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على أنماط التنبيغ التي تحققت بعد التسليم داخل القراب ل AAV9-GFP. تم تلطيخ المقاطع السميكة 40 ميكرومتر من (أ) عنق الرحم و (ب) الصدر و (ج) الحبل الشوكي القطني مناعيا كيميائيا ل GFP (صبغة سوداء). لوحظت مستويات عالية من نقل المادة الرمادية على جميع المستويات. (د) في المقابل، يظهر الدماغ نقادا إجماليا متفرقا. يتم تكبير المربعين الأيمن والأيسر في (E) و (F) على التوالي. (ه) يلاحظ معظم التلوين في المخيخ، وبشكل أساسي في خلايا بركنجي العصبية (الأسهم). (F) تنتقل الخلايا العصبية (الأسهم) والخلايا النجمية (رؤوس الأسهم) داخل القشرة الدماغية. قضبان المقياس: (A-C) 325 ميكرومتر ؛ (د) 5 مم؛ و (E ، F) 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: استنساخ التنبيخ في المخيخ. استنساخ التنبيخ في المخيخ ل 15 فأرا حقنها نفس الجراح باستخدام نفس الجرعة والكثير من الفيروس. شريط المقياس: 1 مم. تشير الأرقام الموجودة في الصور إلى أرقام معرف الفئران ("القمامة"). فرد'). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استنساخ التنبيغ في القشرة. استنساخ التنبيغ في قشرة 15 فأرا حقنها نفس الجراح باستخدام نفس الجرعة والكثير من الفيروس. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. تشير الأرقام الموجودة في الصور إلى أرقام معرف الفئران ("القمامة"). فرد'). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قابلية استنساخ التنبيخ في الحبل الشوكي العنقي. استنساخ التنبيغ في الحبل الشوكي العنقي ل 7 فئران حقنها نفس الجراح باستخدام نفس الجرعة والكثير من الفيروس. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. تشير الأرقام الموجودة في الصور إلى أرقام معرف الفئران ("القمامة"). فرد'). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مجموعة واسعة من الأمراض تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. يعد توفير نسخة وظيفية من الجين ذي الصلة عبر ناقل فيروسي استراتيجية علاجية جذابة لتلك المتنحية والأحادية المنشأ بطبيعتها ، مثل ضمور العضلات الشوكي. ومع ذلك ، فإن الحاجز الدموي الدماغي (BBB) يستبعد معظم نواقل العلاج الجيني التي تعطى عن طريق الوريد11. يجب إعطاء تلك التي يمكن أن تعبر BBB ، مثل AAV9 ، بجرعات عالية للتغلب على فقدان النواقل بسبب النقل المحيطي12. العمر هو أيضا حاجز. يزداد التعرض البيئي لمختلف الأنماط المصلية AAV مع تقدم العمر13 عاما وغالبا ما يؤدي إلى إنتاج أجسام مضادة يمكنها تحييد النواقل العلاجية14. لذلك ، فإن التوصيل الوريدي لنواقل العلاج الجيني لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي يقتصر بشكل عام على الرضع ولا يستخدم في المرضى الذين يتم تشخيصهم لاحقا في الحياة.
بالنسبة للمرضى الأكبر سنا ، يمكن أن يؤدي الحقن المباشر للناقل في السائل الدماغي الشوكي إلى نقل واسع النطاق في الجهاز العصبي المركزي ، متجاوزا كلا من BBB والأجسام المضادة المضادة ل AAV الموجودة مسبقا15. وبما أن هذا النهج مستهدف، يمكن أيضا استخدام جرعات أقل من النواقل. هناك طريقتان أساسيتان في الإعداد السريري: (1) البزل القطني و (2) الحقن في البطينين الجانبيين. هذا الأخير يحمل المزيد من المخاطر ، لكنه يوفر عموما نقل دماغ أكبر. البزل القطني أكثر أمانا ، لكن التنبيع يميل نحو الحبل الشوكي. يمكن تعزيز نقل الدماغ عن طريق وضع المريض في وضع Trendelenburg ، ولكن البيانات المتعلقة بهذا مختلطة16,17. قد يوفر استخدام القسطرة للوصول إلى الصهريج الكبير عبر البزل القطني خيارا أفضل في العيادة ، ولكنه في مرحلة مبكرة من الاستخدام5. قد تكون هناك تحديات أخرى لترجمة الأساليب التي تم وضعها في النماذج الحيوانية إلى العيادة ، مثل فقدان النواقل بسبب تسرب السائل الدماغي الشوكي18 والسمية في العقد الجذرية الظهرية19.
تستخدم معظم الدراسات التي أجريت على العلاجات الموجهة للجهاز العصبي المركزي والتي أجريت على القوارض حديثي الولادة أو البالغة (>60 يوما من العمر). يتمتع حديثو الولادة بميزة صغر حجم الجسم ، مما يسمح بجرعات فعالة أعلى ، ونظام مناعي غير ناضج ، وتجنب مضاعفات الاستجابة المناعية ضد العلاج. ومع ذلك ، من حيث نمو الدماغ ، يمثل الفأر أو الجرذ حديث الولادة بشكل أفضل مرحلة الجنين في البشر. بالنسبة للعلاجات المخصصة للأطفال في الفئة العمرية 5-10 سنوات ، فإن الفئران الأحداث (25-35 يوما) هي نموذج أفضل من حيث التطور العصبي20. نظرا لأن طريقة الحقن داخل القراب لم يتم وصفها من قبل للفئران اليافعة ، وأثبتت الطرق التي تم إنشاؤها للفئران والجرذان البالغة أنها غير فعالة في الفئران في هذا العمر ، فقد تم تطوير النهج الموصوف أعلاه. لكي نكون واضحين ، فإن الفئران اليافعة ليست أصغر من البالغين فحسب ، بل قد تختلف أيضا في مرونة الجافية التي تحمي الحبل الشوكي ، مما يجعل الإجراء الذي يعمل على ثقب هذه الطبقة في الفئران البالغة غير فعال في الأحداث.
عند تعلم كيفية إجراء الحقن داخل القراب في الفئران اليافعة ، من الضروري استخدام صبغة (مثل تريبان بلو) كبديل للعلاج ، ويجب أن يكون المستخدم واثقا للغاية من قدرته على تنفيذ الإجراء بنجاح وتكرار قبل بدء الدراسة باستخدام علاجي. سيتطلب إتقان هذه التقنية ممارسة للحصول على خبرة في كيفية شعور المحقنة عندما يكون المسار على الهدف مقابل خارج الهدف. هناك نوعان من الأخطاء الشائعة. إذا كانت زاوية الاقتراب ضحلة جدا ، فسوف تضرب الإبرة الجزء العلوي من إحدى الصفيحات أو الجزء الخلفي من الصفيحة المنقارية. لن يكون هناك نشل ، وستكون المسافة التي تتقدم بها الإبرة أقل ببضعة ملليمترات من 8 مم. إذا كانت زاوية الاقتراب كبيرة جدا ، فهناك خطر من أن تمر الإبرة بين الصفيحتين وتخترق تجويف البطن. عندما يحدث هذا ، سوف تتقدم الإبرة أبعد بكثير من 8 مم. إذا حدث هذا ، فقم بإزالة الإبرة ، وتغيير موضعها ، وحاول مرة أخرى. في المناسبات القليلة التي حدث فيها هذا ، لم يتسبب الدخول العابر إلى تجويف البطن ببضعة ملليمترات قبل الانسحاب وإعادة التموضع في أي ضرر دائم واضح للحيوانات.
لقد وجد أن مراقبة الاستجابة الجسدية لوضع الإبرة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التكاثر بمعدل نجاح مرتفع في هذا الإجراء. عندما لم تكن هناك استجابة ، كان معدل نجاح الحقن منخفضا. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، تطلب محاولات في مواقع متعددة لتحقيق استجابة ، ولوحظت كميات ضئيلة من الصبغة في واحد أو أكثر من مسارات الإبرة السابقة. لم يلاحظ أي صبغة في الفضاء فوق الجافية ، مما يشير إلى أن بعض أعواد الإبرة السابقة قد اخترقت الجافية دون إنتاج ارتعاش في الذيل أو الساق. نظرا لأن الارتجاع كان ضئيلا (على غرار ما لوحظ في مسار الإبرة من الحقن) ، يعتقد أن تأثير عصي الإبرة السابقة على فعالية التسليم في هذه الحالات كان ضئيلا.
بمجرد أن يحقق المرء الكفاءة في تقنية التسليم ، قد يواجه تحديا ثانيا غير جراحي. على وجه التحديد ، في الفئران البالغة (~ 70 يوما من العمر) ، يمكن أن تختلف قوة ناقلات AAV9 للتوصيل داخل القراب إلى الحبل الشوكي والدماغ اختلافا كبيرا من الكثير إلى القطعة ، حتى عندما يتم إنشاؤها بواسطة نفس النواة المتجهة. ستعمل بعض الدفعات كما هو متوقع ، مما يؤدي إلى نقل المادة الرمادية للحبل الشوكي على طولها. ومع ذلك ، سيفشل البعض الآخر في اختراق المادة الرمادية ، مما يؤدي في المقام الأول إلى تحويل العقد الجذرية الظهرية10. سبب هذا التباين غير واضح ، حيث أن النواقل قوية في المختبر وعند حقنها مباشرة في الحبل الشوكي. يوصى بإجراء دراسة تجريبية ل 3-4 مع أي دفعة جديدة من الفيروس للتأكد من أن المجموعة الجديدة تعمل كما هو متوقع قبل البدء في دراسة كبيرة. يمكن تقييم الفاعلية باستخدام تلطيخ كيميائي مناعي أو مضان مناعي لمنتج جين التحوير البروتيني أو تحديد كمية الحمض النووي الريبوزي المرسال المحوري أو جينومات النواقل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أو ddPCR21. بالإضافة إلى المتغيرات غير المعروفة التي تميز الحصص الفيروسية ، قد تتسبب الاختلافات الصغيرة في عمر وحجم الحقن وسرعة التسليم وتركيز النواقل في تباين النتائج. قبل البدء في دراسة كبيرة ، قد تحتاج إلى تحسينها لكل فيروس أو عامل علاجي مرشح آخر.
بمجرد التدريب ، يمكن للجراح المتمرس إكمال إجراء الحقن داخل القراب للفأر اليافع في غضون 30 دقيقة تقريبا ، من تحريض التخدير إلى بداية فترة التعافي. هذا يسمح بمعالجة الأفواج الكبيرة في فترة زمنية قصيرة. التعافي من الجراحة سريع أيضا. معظم تتنقل عادة في غضون 20-30 دقيقة. بعد إجراء أكثر من 200 من هذه العمليات الجراحية ، لم تتم مواجهة أي آثار ضارة من هذا الإجراء.
أخيرا ، يعد تقليل محنة وضمان رعاية أثناء العمليات الجراحية من الاعتبارات القصوى. وبالتالي ، فإن الاستخدام السليم للتخدير والمسكنات مطلوب ، ويجب الحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء العملية وحتى يتعافى تماما من التخدير. قد يكون للهيئات التنظيمية ذات الصلة والموظفين البيطريين في المؤسسات المختلفة متطلبات وتوصيات مختلفة فيما يتعلق بهذه الموضوعات. تم تطوير استخدام التخدير والمسكنات الموصوفة في هذا الإجراء بالتشاور مع الأطباء البيطريين بجامعة إيموري وموظفي IACUC. يجب على الباحثين العمل بشكل وثيق مع الأطباء البيطريين المحليين و IACUC لتحقيق الأهداف المطلوبة.
هناك بعض القيود على هذا الإجراء. تم تطوير الطريقة الموصوفة هنا للاستخدام في الفئران اليافعة ، وقد تحد الاختلافات الهيكلية وغيرها من الاختلافات بين البشر والجرذان من ترجمة هذه الإجراءات إلى البشر. الهدف من تمكين الحقن القطني داخل القراب للعلاج في الفئران اليافعة هو تسهيل استخدام نموذج الفئران الأحداث لاختبار فعالية العلاج العلاجي المرشح - حتى لو كانت طريقة التسليم الدقيقة بحاجة إلى تغيير للتطبيق في المرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور دونسانتي هو مخترع على براءة اختراع معلقة فيما يتعلق بإدارة CSF لناقلات AAV9.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا ستيفن جراي وماثيو ريو وناندا ريجمي ولاسي ستيرمان من UT Southwestern على مناقشة مثمرة للتحدي الذي تشكله الفئران اليافعة للحقن داخل القراب. تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من جاكوار للعلاج الجيني (إلى JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
