Summary
이 기사는 빠르고 쉽게 접근할 수 있는 성인 Xenopus 의 6가지 중요하고 다양한 장기(심실, 간엽, 췌장, 지방체, 쌍을 이루는 신장 및 피부)를 샘플링하기 위한 가이드를 제공합니다.
Abstract
Xenopus 는 100년 이상 동안 척추동물의 발달과 질병을 이해하기 위한 강력한 모델 유기체였습니다. 배아의 실험적 분석 및 해부 기술은 잘 문서화되어 있지만, 성인 Xenopus 구조 및 장기에 대한 설명과 성인과 함께 작업하는 기술은 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학과 같은 현대적인 접근 방식의 요구 사항을 고려하도록 업데이트되지 않았습니다. 세포 유형 및 유전자 중심적 관점은 배아 단계의 관찰과 성인 조직의 관찰을 대조하는 관찰을 필요로 합니다. 유충의 장기는 유충에서 성충으로의 전환을 따라 전체 구조, 형태 및 해부학적 위치에서 상당한 변화를 겪으며, 특히 대규모 변태 리모델링 중에 큰 변화를 겪습니다. 장기 식별 및 해부에 대한 강력한 표준을 수립하는 것은 서로 다른 실험실에서 수행된 연구의 결과로 얻은 데이터 세트가 일관될 수 있도록 하는 데 중요합니다. 본 프로토콜은 성인 Xenopus의 6 개 장기를 식별하여 성인 Xenopus의 심실, 간, 지방체, 췌장, 쌍 신장 및 피부의 절개 및 샘플링 방법을 보여줍니다. 보존 방법에 따라 절개된 장기는 정량적 단백질체학, 단일세포/핵 전사체학, in situ hybridization, 면역조직화학, 조직학 등에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조직 샘플링을 표준화하고 성인 장기 시스템에 대한 다중 실험실 연구를 촉진하는 것을 목표로 합니다.
Introduction
"성체 Xenopus"의 "디지털 해부"가 가능하지만1, 다른 성체 모델(예: 생쥐 2,3,4)에 대한 자세한 지침 없이는 성체 Xenopus의 복제 가능한 장기 및 조직 샘플링이 여전히 어렵습니다. 이 기사는 현재 유충에 대해 사용할 수 있는 것과 유사한 성인 Xenopus의 정확하고 복제 가능한 장기 샘플링을 위한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다5. 최대한의 신선도를 유지하고 모든 사용자가 프로토콜에 액세스할 수 있도록 완료의 용이성에 중점을 둡니다.
Rana sp.6에 대한 철저한 해부 가이드와 다른 anurans7에 대한 수많은 교실 해부 가이드가 있지만 현재 Xenopus 해부 및 샘플링 가이드는 사용할 수 없습니다. 샘플링 방법이나 양서류 해부학에 익숙하지 않은 사람들을 위해 Xenopus와 다른 anurans 사이의 작은 차이로 인해 이러한 리소스는 복제 가능한 조직 샘플링에 적합하지 않습니다.
많은 귀중한 조직이 포함되어 있지 않으며 현재 가이드에 버려져 있습니다. 이는 조직의 신선도를 보장하기 위한 것입니다. 6개의 샘플은 사용자의 경험이나 기술 수준에 관계없이 심장이 뛰기 시작한 후 한 시간 이내에 이러한 조직을 수집할 수 있을 만큼 충분히 제한되어 있습니다. 다른 많은 조직을 수집하기 위한 보다 고급스럽고 상세한 가이드는 별도의 동반 논문으로 준비 중입니다.
경험이 적은 사용자의 경우, 대체하기 어려운 동물(예: 형질전환, 고령 동물 등)을 샘플링하기 전에 실험 이외의 이유로 안락사되는 동물에 대해 이 프로토콜을 먼저 시도하는 것이 항상 권장됩니다. 이상적으로는 표본을 채취한 모든 동물이 건강해야 하며, 암컷인 경우 지난 2주 동안 배란이 되지 않았을 것입니다.
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Protocol
모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행되었습니다. 대표적인 결과는 관류된 및 관류되지 않은 성숙한 알비노 수컷 Xenopus laevis 모두에 대해 표시됩니다.
1. 실험 준비
알림: 샘플링 전에 관류 프로토콜8 을 따르는 경우 2.2단계로 건너뜁니다.
- 연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 기술을 승인했는지 확인하십시오.
- 5g/L MS-222(트리카인 메탄설포네이트) 및 5g/L 중탄산나트륨 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 그 부피는 안락사되는 동물을 완전히 덮는 데 필요한 부피보다 커야 합니다. pH가 ≥7인지 확인하십시오.
- Xenopus를 안락사 용액에 넣어 1 차 안락사를 수행합니다. 동물은 총 1시간 동안 물속에 있습니다.
- 샘플링 직후 모든 조직을 냉각 PBS 또는 0.7x PBS9 (실험 요구 사항에 따라 다름)로 헹구고 확인하고 5x(또는 그 이상) 배율 조명 아래에서 트리밍할 수 있도록 절개 스테이션을 설정합니다. 또한 이 스테이션은 사용자가 모든 집게와 가위를 교체하거나 사용 사이에 깨끗하게 닦을 수 있도록 해야 합니다.
- 개구리가 1시간 동안 용액에 있으면 1차 안락사가 완료됩니다. 개구리를 제거하고 발 꼬집기를 실시하여 통증 반응의 소실을 확인하십시오.
- 동물에 대한 종, 품종, 성별, 연령 및 건강 상태와 같은 적절한 세부 정보를 기록하고 관류되었는지 여부를 기록합니다. Xenopus 의 무게를 측정하고 길이와 같은 추가 측정을 수행합니다.
- 개구리를 등에 눕히고 몸통에 근접한 팔다리를 고정합니다(그림 1).
- 해부 가위를 사용하여 피부를 뚫고 정중선을 따라 자른 다음 측면으로 두 개의 플랩을 만듭니다.
- 그림 2를 참조하여 linea alba를 식별하고 겸자를 사용하여 잡고 coelomic cavity에서 빼냅니다. 가위를 사용하여 근육 조직을 조심스럽게 자릅니다. 캐비티 벽에서 두 개의 플랩을 만듭니다. 모든 플랩을 자르거나 핀으로 고정합니다.
- 여전히 뛰고 있는 심장을 식별합니다. 절개 가위를 사용하여 코라코이드 뼈를 줄여 (그림 2) 심장에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다.
알림: 샘플링 전에 심장 박동이 멈춘 경우 s의 신선도가 손상되었다는 점에 유의해야 합니다.
2. 샘플링
알림: 동물이 관류된 경우 2.2단계로 건너뜁니다.
- 얇은 심낭을 확인하고 조직 겸자로 팽팽하게 당깁니다(그림 3).
- 홍채 절제술 가위의 끝을 사용하여 심낭을 부드럽게 천공하고 아래 조직이 절단되지 않도록 주의합니다. 심장의 3개 방에서 심낭을 떼어냅니다.
- 집게를 사용하여 심실의 정점을 잡고 귓바퀴와 동맥 줄기에 부착되는 위치를 식별하고(그림 4), 이러한 부착물 아래를 자릅니다(그림 5). 필요한 경우 귓바퀴나 동맥줄기의 조직이 보이지 않도록 심실을 다듬고 심실 내부에서 밝은 색의 판막 조직이 계속 보이도록 합니다.
참고: 관류되지 않은 동물의 경우, 심실을 제거하는 것은 2차 안락사에 해당할 수 있습니다. - 간의 3개의 엽이 보일 것입니다(그림 6 및 그림 7). 좌엽의 입술(관찰자의 오른쪽)을 잡고 간관과 낭포관이 보이도록 부드럽게 들어 올립니다(그림 8). 이 부착물 아래에 있는 로브의 아래쪽 1/3을 샘플링합니다(그림 9).
- 암컷 개구리의 조직에 더 잘 접근하려면 난소를 제거하는 것이 도움이 됩니다. 생식 상피(germinal epithelium)라고 하는 내장 복막층으로 둘러싸인 난소를 식별합니다. 부착 영역이 보이도록 로브가 각각의 측면에 올 때까지 로브를 부드럽게 움직입니다(그림 10). 이러한 부착물은 쌍을 이루는 신장에 직접 복부에 있습니다.
- 가위를 사용하여 난소를 손상시키지 않고 가능한 한 신장에 가깝게 제거합니다(그림 11).
- 간의 내엽(전엽이라고도 함)을 검사하고 장간막과 간췌관(총담관이라고도 함)을 통해 위와 십이지장과 어떻게 연결되어 있는지 확인합니다(그림 6, 그림 7 및 그림 8).
- 장간막, 간십이지장 인대를 홍채 절제술 가위를 사용하여 절단하고 십이지장과 만나는 간췌관을 절단합니다. 췌장과 간췌관과 간의 내엽 연결을 절단하여 어두운 간 조직이 부착되지 않도록 합니다(그림 12).
- 톱니가 있는 집게로 배를 잡고 조직 집게로 췌장의 위쪽 끝을 잡습니다. 5배 확대하여 위에서 췌장을 부드럽게 떼어냅니다(그림 13).
알림: 깨끗하게 제거되지 않으면 남아 있는 췌장 조직이 보이고 조각으로 벗겨질 수 있습니다. 또는 홍채 절제술 가위와 조직 집게를 사용하여 췌장을 체계적으로 분리할 수 있습니다. - 그림 14A를 참조하여 방광을 식별하고 제거하고 가능한 한 배설물에 가깝게 절단합니다. 이 티슈를 버리십시오.
- 그림 14B를 참조하여 대장을 식별하고 팽팽하게 당겨 대장을 가능한 한 배설물에 가깝게 절단합니다. 소화관 전체를 제거하고 버리고 비장에 부착되는 복막을 절단합니다. 뚱뚱한 몸은 이제 완전히 접근 할 수 있습니다.
- 뚱뚱한 몸을 떼어내어 각자의 편에 서도록 합니다. 지방체가 복막과 연결되는 신장 위 부위가 보일 것입니다. 왼쪽 뚱뚱한 몸의 기저부(관찰자의 오른쪽)를 잡고 가위를 사용하여 복막에서 잘라내고 신장이 손상되지 않도록 작은 여백을 남깁니다(그림 15).
- 남은 뚱뚱한 몸을 제거하고 버립니다. 이제 한 쌍의 신장이 완전히 보일 것입니다.
- 뚜렷한 흔적 난관이 있는 암컷 개구리 또는 수컷의 경우 난관을 잡고 신장과 배설물에서 당겨 빼냅니다(그림 16). 배설물과 만나는 부분의 난관을 자르고 신장에서 계속 잡아당겨 투명한 복막 부착물이 눈에 띄면 잘라냅니다. 이 티슈를 버리십시오.
- 나머지 난관에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 콩팥은 여전히 투명한 복막(후복막)으로 덮여 있습니다10. 겸자를 사용하여 신장을 잡고 아래쪽 끝부분의 복막을 절단합니다.
- 가위를 사용하여 복막을 손상시키지 않고 신장에 최대한 가깝게 절단하여 콩팥강에서 콩팥을 들어 올립니다(그림 17).
- 5배 확대하여 과도한 복막과 기타 남아 있는 조직(지방체, 비장)을 잘라냅니다. 개구리가 암컷인 경우 남아 있는 난소 조직을 제거해야 합니다(그림 18). 개구리가 수컷인 경우 고환을 조심스럽게 제거하고 확대하지 않으면 보이지 않을 수 있는 흔적 난관이 있는지 확인합니다(그림 19).
- 동물의 핀을 제거하고 복부에 뒤집은 다음 동물의 팔다리를 다시 핀합니다.
- 샘플링할 뒷다리 중 하나를 선택하고 해당 팔다리의 발을 고정합니다.
- 비복근/경골 비골 위에서 아몬드 모양의 피부 플랩을 제거합니다(그림 20).
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Representative Results
그림 1에서 그림 20을 활용하고 이 프로토콜의 모든 단계를 따름으로써, 심실, 간의 좌엽, 췌장, 좌측 지방체, 한 쌍의 신장 및 피부 피판이 안락사 후 한 시간 이내에 깨끗하게 절제되었습니다. 이 시간 내에 샘플은 그림 21과 같이 나타나도록 헹구고 다듬습니다.
그림 1: 고정된 Xenopus. 성숙한 암컷 X. tropicalis는 각 팔다리를 통해 핀으로 고정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 복벽. X. tropicalis 암컷의 복부 피부는 플랩으로 절단되어 linea alba와 coracoid 뼈를 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 심낭으로 둘러싸인 심장. 심실의 정점은 심낭을 통해 잡힙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 심실과 동맥 줄기. 관류된 X laevis 의 심실이 잡히고 동맥 줄기에 부착되어 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 하트 다이어그램. 심실을 샘플링할 위치를 나타내는 점선이 있는 심장의 관련 구조 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 간췌장 다이어그램. 간, 췌장 및 관련 장기의 3개 엽에 대한 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 간췌장 장기. 관류된 알비노 X. laevis 수컷으로 간, 췌장 및 관련 장기의 3개 엽이 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 낭포성 및 간관. 간의 좌엽을 들어 올려 관류된 X. laevis의 낭포관과 간관을 보여주고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 간 샘플링. 비관류(unperfusion) X. tropicalis 의 좌측 간엽(left liver lobe)은 간관(hepatic ducts)의 부착물 아래에서 절단되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 난소 부착. 난소엽이 각각의 측면에 있으면 생식 상피가 복막 벽(신장 위)까지 이어지는 연속성을 볼 수 있습니다. 두 개의 흰색 점선은 이러한 첨부 파일을 끊을 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 난소 제거. 관류되지 않은 X. laevis 의 난소는 한 쌍의 신장에서 당겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 혈관 절개. 비관류된 X. laevis 의 coelomic cavity, 간의 심실과 좌엽의 샘플링 및 난소 제거에 따른 것. 흰색 점선은 간췌장 인대와 유관을 절단할 위치를 나타내고, 녹색 점선은 간의 내엽에서 췌장을 절단할 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: 췌장 샘플링. 관류되지 않은 X. laevis 의 췌장이 위장에서 제거되고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 14: 장기 제거. (A) 관류되지 않은 X. laevis 의 방광은 절단 위치를 나타내는 점선과 함께 배설물에서 당겨집니다. (B) 관류되지 않은 X. laevis의 대장이 배설물에서 떨어져 나가고 있으며, 절단할 위치를 나타내는 점선이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 15: 뚱뚱한 몸 표본 추출. 한 쌍을 이루는 신장의 위쪽 끝에 있는 복막에 붙어 있는 뚱뚱한 몸체는 절단 위치를 보여주는 점선으로 coelomic cavity에서 뽑아냅니다. 이 부착물에 인접하여 이 남성 X. tropicalis 에는 1개의 고환과 한 쌍의 뚜렷한 흔적 난관이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 16: 난관 제거. 관류된 X. laevis 의 난관은 한 쌍의 신장에서 당겨져 투명한 복막을 볼 수 있습니다. 점선은 복막을 절개할 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 17: 신장 샘플링. 관류되지 않은 X. laevis 의 한 쌍의 신장이 coelomic cavity에서 들어 올려지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 18: 신장 트리밍. (A) 관류되지 않은 여성 X. laevis의 한 쌍의 신장과 관련 복막 기관이 부착된 복부 모습. (B) 관련 장기가 제거되었지만 일부 복막 조직이 남아 있는 동일한 신장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 19: 고환 제거. unperupused X. tropicalis 의 쌍을 이루는 신장과 하나의 고환이 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 20: 스킨 샘플링. (A) X. tropicalis 의 오른쪽 다리와 샘플링할 피부 영역을 나타내는 점선. (B) 경골 비골 위에 피부 샘플이 제거된 X. tropicalis 의 오른쪽 다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 21: 장기 샘플링의 대표 결과. 심장실, 간, 췌장, 뚱뚱한 몸체, 한 쌍의 신장 및 관류되지 않은 알비노 X. laevis에서 채취한 피부 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 신선도를 극대화하는 것을 목표로 하기 때문에 일부 샘플에는 원치 않는 조직이 포함될 수 있습니다. 예를 들어, 간췌관과 일부 장간막은 췌장으로 샘플링되며, 일부 복막 조직, 부신 및 요관은 항상 쌍을 이루는 신장으로 샘플링됩니다. 신선도가 문제가 되지 않는 경우 수정된 기술을 사용하여 보다 정확한 샘플링을 얻을 수 있습니다.
장기의 모양과 위치는 Xenopus의 성별과 종간에 비슷합니다. 그러나 조직의 색상은 동물이 관류되었는지 여부에 따라 크게 다릅니다. 이러한 이유로 관류된 동물과 관류되지 않은 동물의 이미지가 모두 포함됩니다.
이 프로토콜의 제약 조건은 원하는 조직 전체를 가장 잘 나타내는 샘플을 수집하는 것보다 속도와 재현성이 우선시된다는 것입니다. 예를 들어, 여기에서 샘플링한 간의 좌엽 부분은 간 조직의 3개 엽을 모두 적절하게 나타낼 수 없습니다. 샘플링에 오류가 있는 경우, 문제 해결 옵션은 조직의 다른 부분 간의 변동 가능성에 의해 영향을 받습니다. 예를 들어, 간의 우엽, 우측 지방체 또는 피부의 다른 부분이 원하는 조직에 대한 기능적 대안인지 여부는 알려져 있지 않습니다. 이러한 경우, 조직의 단면을 대체하기 전에 연구의 필요에 따라 재량권을 사용해야 합니다.
이 프로토콜의 또 다른 제한 사항은 샘플링되는 동물에 급격한 해부학적 결함이 있거나 임상적으로 중요한 건강 문제가 있는 경우 coelomic cavity의 장기가 여기에 설명된 대로 나타나지 않을 수 있다는 것입니다. Mycobacterium spp.11,12에 감염된 개구리의 조직에서 육아종이 발견되었으며, 이전에 난소 과자극 증후군을 앓았던 사례에서는 장기의 이상이 나타나는 것으로 보인다13.
이 방법은 실험실 Xenopus를 위해 개발되었지만, 많은 비 caecilian 양서류 및 사지 파충류 내에서 이러한 기관의 모양에는 상당한 유사성이 있습니다14. 이 프로토콜의 샘플링 부분은 axolotls 또는 green anole과 같은 다른 모델에 대해 쉽게 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH의 OD 보조금 R24OD031956의 지원을 받았습니다. 도움과 지원을 아끼지 않은 Samantha Jalbert, Jill Ralston, Cora Anderson과 편집자 및 익명의 피어 리뷰어에게 유용한 피드백을 주셔서 감사합니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
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