כריתת כבד מורחבת של 78% במודל כירורגי עכבר
Summary
מודל העכבר של כריתת כבד חלקית 2/3 (66%) מתואר היטב בספרות, אך לעתים רחוקות נעשה שימוש בכריתת כבד ממושכת יותר המחקה תסמונת קטנה לגודל לאחר השתלת כבד. אנו מתארים הליך מורחב של 78% כריתת כבד במודל עכבר שמביא לכ-50% קטלניות לאחר הניתוח בעכברים בריאים.
Abstract
כריתת כבד חלקית של 2/3 בעכברים משמשת במחקר לחקר יכולת ההתחדשות של הכבד ולחקור את התוצאות של כריתת כבד במספר מודלים של מחלות. בכריתת כבד חלקית קלאסית של 2/3 בעכברים, שתיים מתוך חמש אונות הכבד, כלומר האונות השמאלית והחציונית המייצגות כ-66% ממסת הכבד, מנותחות בגוש , עם הישרדות צפויה לאחר הניתוח של 100%. כריתת כבד חלקית אגרסיבית יותר היא מאתגרת יותר מבחינה טכנית ולכן כמעט ולא נעשה בה שימוש בעכברים. הקבוצה שלנו פיתחה מודל עכברי של טכניקת כריתת כבד מורחבת שבה שלוש מתוך חמש אונות הכבד, כולל האונות העליונות השמאלית, החציונית והימנית, נכרתות בנפרד כדי להסיר כ -78% ממסת הכבד הכוללת. כריתה ממושכת זו, בעכברים בריאים אחרת, מותירה שאריות כבד שלא תמיד יכולות לקיים התחדשות מספקת ובזמן. כישלון בהתחדשות גורם בסופו של דבר לקטלניות של 50% לאחר הניתוח תוך שבוע אחד עקב אי ספיקת כבד פולמיננטית. הליך זה של כריתת כבד מורחבת של 78% בעכברים מייצג מודל כירורגי ייחודי לחקר תסמונת קטנה בגודל והערכת אסטרטגיות טיפוליות לשיפור התחדשות הכבד והתוצאות במסגרת השתלת כבד או כריתת כבד מורחבת לסרטן.
Introduction
מודלים של כריתת כבד כירורגית של עכברים וחולדות, שתוארו לראשונה בשנת 1931, הם המודלים הניסיוניים הנפוצים ביותר המשמשים לחקר הבסיס המולקולרי של התחדשות הכבד. הם יכולים גם להיות שימושיים במחקר מדעי תרגומי כדי לבדוק ולפתח אסטרטגיות לשיפור התוצאות לאחר כריתת כבד מורחבת או השתלת שתלי כבד תת-אופטימליים 1,2,3,4. כריתת כבד חלקית (PH) בעכברים כרוכה בהסרה של כ -2/3 (66%) ממסת הכבד הכוללת (TLM), אשר כאשר מבוצעת בבעלי חיים בריאים יש תוצאות יוצאות דופן5. ההליך קצר במשכו, ניתן לשחזור בקלות עקב שונות קטנה באנטומיה של כבד העכבר, וההישרדות לאחר הניתוח מתקרבת בדרך כלל ל -100%1.
כריתת כבד חלקית של 2/3 המקיפה את כריתת האונה השמאלית (LL) והאונה החציונית (ML) מאפשרת לאונות השיוריות להתחדש יחסית ללא הפרעה על ידי דלקת לוברית או הגבלה של זרימת הכבד והחוצה. במקום זאת, זרימה ורידית פורטלית מוגברת ולאחר מכן לחץ גזירה על תאי אנדותל סינוסואידים בכבד בעקבות PH גורמים להגברת ויסות מתמשך של ביטוי תחמוצת החנקן האנדותל סינתאז (eNOS) ולאחר מכן שחרור תחמוצת החנקן (NO), אשר תורמים להכנה של הפטוציטים לשגשוג והתחדשות הכבד3. תוצאות הנחקרות בדרך כלל לאחר 2/3 PH במודלים של מחלות כגון מחלת כבד שומני לא אלכוהולי או ברקע גנטי ספציפי כוללות סיכון לאי ספיקת כבד חריפה, מדדים איכותיים וכמותיים של יכולת התחדשות הכבד, ותגובות ביולוגיות אחרות ללחץ או לפציעה טראומטית 1,3.
עם זאת, מודל עכברי המחקה תסמונת תפקודית או אנטומית קטנה לגודל, כפי שהיא מתרחשת לאחר כריתת כבד ממושכת לסרטן או השתלת כבד שולי (סטאטוזיס או זמן איסכמי ממושך) או חלקי (מפוצל או מכבד תורם חי), נותר מבוסס היטב. כדי לענות על צורך זה, נדרשים מודלים של כריתות כבד נרחבות יותר המשתרעות מעבר לשמירה על מסת כבד מינימלית (ותפקודית) כדי למדל תסמונת כבד בגודל קטן ואת התמותה המוגברת הקשורה לתסמונתזו 6,7.
האנטומיה של כבד העכבר מציגה שונות מינימלית. כבד העכבר מורכב מחמש אונות, שכל אחת מהן מהווה את האחוז הבא ממסת הכבד הכוללת: אונה שמאלית (LL; 34.4 ± 1.9%), אונה חציונית (ML; 26.2 ± 1.9%), אונה ימנית עליונה (נקראת גם עליונה ימנית) (RUL; 16.6 ± 1.4%), אונה ימנית תחתונה (נקראת גם תחתונה ימנית) (RLL; 14.7 ± 1.4%), ואונה קאודטית (CL, 8.1 ± 1.0%)1, 5. כל אונה מסופקת על ידי שלישיית פורטל, הכוללת ענף של עורק הכבד, ענף של וריד הפורטל, וצינור מרה5. מבחינה היסטורית, תוארו מספר טכניקות לביצוע PH של 2/3 על ידי כריתת LL ו- ML. אלה כוללים: 1) הטכניקה הקלאסית המורכבת מליגטורה אחת בבסיס כל אחת מהאונות המנותחות; 2) טכניקת קליפ המוסטטי, באמצעות קליפסים מטיטניום המיושמים בבסיס האונות המנותחות; 3) טכניקה משמרת פרנכימה מונחית כלי, תוך שימוש בתפרים חודרים פרוקסימליים למהדק; ו-4) טכניקה מיקרוכירורגית מוכוונת כלי דם, לפיה הווריד הפורטלי ועורק הכבד קשורים לפני כריתת אונה1. בעוד שלכל טכניקה יש חוזקות וחולשות יחסיות, אף אחת מהן אינה מניבה קטלניות גבוהה יותר 1,8,9.
במחקר זה אנו מציגים שיטה חדשנית ל-78% PH מורחב בעכברים. במודל הזה, שלוש מתוך חמש אונות כבד, כולל LL, ML ו-RUL, מוסרות בנפרד באמצעות טכניקת ליגטורה (איור 1). הליך זה גורם לכריתה של כ -78% (77.2 ± 5.2%) ממסת הכבד הכוללת. הבחירה שלנו להסיר את LL ו- ML בנפרד, ולא “en bloc” כמו בטכניקת PH קלאסית, ממזערת סיבוכים הקשורים לכריתה en bloc של שתי אונות אלה, כגון היצרות וריד נבוב על-הכבד וסיכון מוגבר לנמק של האונות הנותרות כאשר הליגטורה היחידה מוחלת קרוב מדי לווריד קאווה1, 10,11,12,13,14. זה חיוני לפני המעבר לשלב הסופי של הליך זה כדי להסיר את RUL. כריתת כבד נרחבת זו בעכברים בני 8-12 שבועות, מסוג פרא C57BL/6 גורמת לקטלניות של 50% תוך שבוע מהניתוח עקב התחדשות כבד כושלת הגורמת לאי ספיקת כבד15,16. מודל עכברי זה של קטלניות מוגברת לאחר כריתת כבד ממושכת של 78% משחזר כראוי את הפתופיזיולוגיה של תסמונת קטנה לגודל ומאפשר פיתוח ובדיקה של אסטרטגיות חדשניות לשיפור התוצאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לבצע בהצלחה כריתת כבד מורחבת של 78% הגורמת לקטלניות של 50% בעכברים, חיוני שכל אונת כבד תועבר כריתה מדויקת. רמה זו של מיומנות ודיוק יכולה להיות מושגת רק אם ההליך מבוצע שוב ושוב. עקומת האימון משתנה בין המפעילים אך בדרך כלל דורשת 3-6 חודשי תרגול. כריתת כבד שמסירה פחות מ-78% מה-TLM תגרום לשיעורי היש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01 של NIH DK063275 HL086741 ל- CF. PB ו- TA הם מקבלי מלגת NRSA מ- NHLBI T32 מענק הכשרה HL007734.
Materials
| 2 x 2 Gauze | Covidien | 2146 | Surgery: dissection |
| 5-O Nylon Monofilament Suture | Oasis | 50-118-0631 | Surgery: Skin closure |
| 5-O Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Surgery: liver lobe ligation |
| 5-O Vicryl Suture | Ethicon | NC9335902 | Surgery: Abdominal wall closure |
| Addson Forceps | Braintree Scientific | FC028 | Surgery: dissection |
| Alcohol Swabs (2) | BD | 326895 | Disinfectant |
| Buprenorphine Extended Release Formulation | Zoopharm | N/A | Analgesia |
| Cordless Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9868-14 | Shaving |
| Curved Forceps | Braintree Scientific | FC0038 | Surgery: dissection |
| Hemostat | Braintree Scientific | FC79-1 | Surgery: dissection |
| Isoflurane Inhalant Anesthetic | Patterson Veterinary | RXISO-250 | General Anesthesia |
| Magnet Fixator (2-slot) (2) | Braintree Scientific | ACD-001 | Surgery: to hold small retractors |
| Magnet Fixator (4-slot) | Braintree Scientific | ACD-002 | Surgery: to hold small retractors |
| Microscissors | Braintree Scientific | SC-MI 151 | Surgery: dissection |
| Operating tray | Braintree Scientific | ACD-0014 | Surgery: for establishment of surgical field |
| Povidone Iodine 10% Swabstick (2) | Medline | MDS093901ZZ | Disinfectant |
| Scalpel (15-blade) | Aspen Surgical Products | 371615 | Surgery: dissection |
| Sharp Scissors (Curved) | Braintree Scientific | SC-T-406 | Surgery: dissection |
| Sharp Scissors (Straight) | Braintree Scientific | SC-T-405 | Surgery: dissection |
| Small Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | Surgery: dissection |
| Tissue Forceps (Straight x2) | Braintree Scientific | FC1001 | Surgery: dissection |
| Warming Pad (18" x 26") | Stryker | TP 700 | Warming |
| Warming Pad Pump | Stryker | TP 700 | Warming |
| Wire Handle Retractor (2) | Braintree Scientific | ACD-005 | Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity |
| Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System | Braintree Scientific | EZ-108SA | General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M) |
References
- Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28 (1), 3-11 (2008).
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of the liver I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Koniaris, L. G., McKillop, I. H., Schwartz, S. I., Zimmers, T. A. Liver regeneration. J Am Coll Surg. 197 (4), 634-659 (2003).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43 (2), S45-S53 (2006).
- Inderbitzin, D., et al. Magnetic resonance imaging provides accurate and precise volume determination of the regenerating mouse liver. J Gastrointest Surg. 8 (7), 806-811 (2004).
- Clavien, P. A., et al. What is critical for liver surgery and partial liver transplantation: size or quality. Hepatology. 52 (2), 715-729 (2010).
- Dahm, F., Georgiev, P., Clavien, P. A. Small-for-size syndrome after partial liver transplantation: definition, mechanisms of disease and clinical implications. Am J Transplant. 5 (11), 2605-2610 (2005).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Kamali, C., et al. Extended liver resection in mice: state of the art and pitfalls-a systematic review. Eur J Med Res. 26 (1), 6 (2021).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Borowiak, M., et al. Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (29), 10608-10613 (2004).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Lab Anim (NY). 37 (11), 529-532 (2008).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J Invest Surg. 16 (2), 99-102 (2003).
- Mitchell, C., Willenbring, H. Erratum: A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc. 9 (6), 1532 (2014).
- Studer, P., et al. Significant lethality following liver resection in A20 heterozygous knockout mice uncovers a key role for A20 in liver regeneration. Cell Death Differ. 22 (12), 2068-2077 (2015).
- Longo, C. R., et al. A20 protects mice from lethal radical hepatectomy by promoting hepatocyte proliferation via a p21waf1-dependent mechanism. Hepatology. 42 (1), 156-164 (2005).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Diehl, A. M., Rai, R. M. Liver regeneration. 3. Regulation of signal transduction during liver regeneration. FASEB J. 10 (2), 215-227 (1996).
- . A comparison of selected organ weights and clinical pathology parameters in male and female CD-1 and CByB6F1 hybrid mice 12-14 weeks in age Available from: https://www.criver.com/sites/default/files/resources/doc_a/AComparisonofSelectedOrganWeightsandClinicalPathologyParametersinMaleandFemaleCD-1andCByB6F1HybridMice12-14WeeksinAge.pdf (2023)
- CD-1® IGS mouse. Charles River Laboratories Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-1r-igs-mouse?region=3611 (2023)
- C57BL/6J mouse organ weight. The Jackson Laboratory Available from: https://www.jax.org/de/-/media/jaxweb/files/jax-mice-and-services/b6j-data-summary.xlsx (2023)
- Inderbitzin, D., et al. Regenerative capacity of individual liver lobes in the microsurgical mouse model. Microsurgery. 26 (6), 465-469 (2006).
- Zhou, X., et al. L-carnitine promotes liver regeneration after hepatectomy by enhancing lipid metabolism. J Transl Med. 21 (1), 487 (2023).
- Linecker, M., et al. Omega-3 fatty acids protect fatty and lean mouse livers after major hepatectomy. Ann Surg. 266 (2), 324-332 (2017).
- Haber, B. A., et al. High levels of glucose-6-phosphatase gene and protein expression reflect an adaptive response in proliferating liver and diabetes. J Clin Invest. 95 (2), 832-841 (1995).
- Rickenbacher, A., et al. Arguments against toxic effects of chemotherapy on liver injury and regeneration in an experimental model of partial hepatectomy. Liver Int. 31 (3), 313-321 (2011).
- Aravinthan, A. D., et al. The impact of preexisting and post-transplant diabetes mellitus on outcomes following liver transplantation. Transplantation. 103 (12), 2523-2530 (2019).
- Gonzalez, H. D., Liu, Z. W., Cashman, S., Fusai, G. K. Small for size syndrome following living donor and split liver transplantation. World J Gastrointest Surg. 2 (12), 389-394 (2010).
- Mahmud, N., et al. Risk prediction models for post-operative mortality in patients with cirrhosis. Hepatology. 73 (1), 204-218 (2021).
- Kooby, D. A., et al. Impact of steatosis on perioperative outcome following hepatic resection. J Gastrointest Surg. 7 (8), 1034-1044 (2003).
- Ma, K., et al. A mesenchymal-epithelial transition factor-agonistic antibody accelerates cirrhotic liver regeneration and improves mouse survival following partial hepatectomy. Liver Transpl. 28 (5), 782-793 (2022).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Ramsey, H. E., et al. A20 protects mice from lethal liver ischemia/reperfusion injury by increasing peroxisome proliferator-activated receptor-alpha expression. Liver Transpl. 15 (11), 1613-1621 (2009).
- Arvelo, M. B., et al. A20 protects mice from D-galactosamine/lipopolysaccharide acute toxic lethal hepatitis. Hepatology. 35 (3), 535-543 (2002).
