Summary
Mikrohardhed er en mekanisk egenskab og en informativ parameter til evaluering af hårdt vævspatofysiologi. Her demonstrerer vi en standardiseret protokol (prøveforberedelse, polering, flad overflade og indrykningssteder) til mikrohårdhedsanalyse i tand- og alveolær knogle i modeller for oral sygdom hos gnavere, nemlig dental fluorose og ligatur-induceret periodontal knogleresorption.
Abstract
Den mekaniske egenskab, mikrohardhed, evalueres i tandemalje, dentin og knogle i orale sygdomsmodeller, herunder dental fluorose og parodontitis. Micro-CT (μCT) giver 3D-billeddannelsesinformation (volumen og mineraltæthed), og scanningelektronmikroskopi (SEM) producerer mikrostrukturbilleder (emaljeprisme og knoglelakune-kanalformet). Som supplement til strukturel analyse af μCT og SEM er mikrohårdhed en af de informative parametre til evaluering af, hvordan strukturelle ændringer ændrer mekaniske egenskaber. På trods af at det er en nyttig parameter, er undersøgelser af mikrohardhed af alveolær knogle i orale sygdomme begrænsede. Til dato er der rapporteret om divergerende mikrohårdhedsmålemetoder. Da mikrohårdhedsværdier varierer afhængigt af prøveforberedelsen (polering og flad overflade) og indrykningssteder, kan forskellige protokoller forårsage uoverensstemmelser mellem undersøgelser. Standardisering af mikrohårdhedsprotokollen er afgørende for konsekvent og nøjagtig evaluering i orale sygdomsmodeller. I denne undersøgelse demonstrerer vi en standardiseret protokol til mikrohårdhedsanalyse i tand- og alveolær knogle. De anvendte prøver er som følger: til dental fluorosemodellen blev fortænder indsamlet fra mus behandlet med / uden fluorholdigt vand i 6 uger; til ligatur-induceret periodontal knogleresorption (L-PBR) model blev alveolære knogler med periodontal knogleresorption indsamlet fra mus ligeret på den maksillære 2. molar. Ved 2 uger efter ligeringen blev maxillaen opsamlet. Vickers hårdhed blev analyseret i disse prøver i henhold til den standardiserede protokol. Protokollen indeholder detaljerede materialer og metoder til harpiksindlejring, seriel polering og indrykningssteder for fortænder og alveolære. Så vidt vi ved, er dette den første standardiserede mikrohardhedsprotokol, der evaluerer de mekaniske egenskaber af tand og alveolær knogle i modeller for oral sygdom hos gnavere.
Introduction
Hårdhed er en af de mekaniske egenskaber (fx elasticitet, hårdhed, viskoelasticitet og brudadfærd) og bruges almindeligvis til at karakterisere evnen til at modstå kompressionsdeformation og brud på et lokalt område af et materiale. Den statiske indrykningshårdhedstest er den mest anvendte metode, herunder Vickers hårdhed og Knoop hårdhed1. Vickers hårdhedstest implementeres ved at trykke en diamantindenter i overfladen under en fast testbelastning. Indenteren er pyramideformet med en firkantet base og en vinkel på 136 ° mellem modsatte flader. Længden af begge diagonaler dannet på testoverfladen måles, og gennemsnittet bruges til at beregne hårdheden, som bestemmes af forholdet F / A (hvor F er kraften og A er indrykningens overfladeareal). Vickers mikrohardhedstal (HV = F / A) udtrykkes normalt i kilogramkraft (kgf) pr. mm2 indrykning, med 1 HV ≈ 0,1891 F / d2 (N / mm2). Knoop-hårdheden består også af en diamantfirkantet pyramideindenter dannet af to ulige modsatte vinkler. Knoop-hårdhedstallet (HK) er lig med forholdet mellem påført belastning og det projicerede kontaktområde. Hårdhedstest klassificeres i mikroindrykningstest (mikrohårdhed) og makroindrykningstest afhængigt af den kraft, der påføres testmaterialet. Mikroindrykningstest bruger typisk belastninger i området 0,01-2 N (ca. 1-203 gf); I mellemtiden bruger makroindrykningstest over 10 N (10119 gf)1.
For at evaluere træk ved tandhårdt væv i orale sygdomme, herunder tand- og alveolær knogle, anvendes mikro-CT (μCT) og scanningelektronmikroskopi (SEM) til strukturel analyse. μCT giver 3D-billeddannelsesinformation (volumen og mineraltæthed)2, og SEM producerer mikrostrukturbilleder (emaljeprisme og knoglelakune-kanalformet)3. Som supplement til strukturel analyse af μCT og SEM er mikrohårdhed en af de informative parametre til evaluering af, hvordan strukturelle ændringer ændrer de mekaniske egenskaber af tand og alveolær knogle i orale sygdomme, fx emaljemisdannelse og periodontal knogleresorption. Vickers mikrohårdhedsværdi af menneskelig emalje (HV = 283-374) er ca. 4 til 5 gange højere end dentin (HV = 53-63)4,5. I gnaver-dental fluorosemodeller falder emaljemikrohårdheden signifikant i musefortænder behandlet med fluor (HV = 136) sammenlignet med kontrolemalje (HV = 334)6,7. Dette tyder på, at fluoreret emalje er blødere og svagere med lavere mineralindhold og højere proteinindhold end fundet i ikke-fluoreret emalje. Mikrohardhed bruges til at evaluere knoglemekaniske egenskaber. Flere tidligere undersøgelser har undersøgt den mekaniske opførsel af menneskelig knogle fra forskellige anatomiske steder, herunder lang knoglemikrohardhed 8,9,10. Den gennemsnitlige mikrohårdhed af humane fluorerede lårben viste et signifikant fald (HV = 222,4) sammenlignet med ikke-fluorerede lårben (HV = 294,4)11. På trods af at det er en nyttig parameter, er der mangel på litteratur, der beskriver mikrohardhed (enten Vickers12 eller Knoop 13,14) af alveolær knogle i orale sygdomme.
Til dato er der rapporteret om divergerende mikrohårdhedsmålemetoder. Da mikrohårdhedsværdier varierer15 afhængigt af prøveforberedelse (polering og flad overflade) og indrykningssted, kan forskellige protokoller forårsage uoverensstemmelser mellem undersøgelser. Standardisering af mikrohårdhedstestprotokollen er afgørende for konsekvent og nøjagtig evaluering i orale sygdomsmodeller. I denne undersøgelse demonstrerer vi en standardiseret protokol for mikrohårdhedsanalyse i tand- og alveolær knogle i muse-dental fluorosemodel og periodontal knogleresorptionsmodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer beskrevet i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjer og forskrifter for brug af hvirveldyr, der er godkendt af Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) ved Augusta University og Nova Southeastern University, som er akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Bemærk, at Dr. Suzuki var ansat ved Augusta University, hvor muse dental fluorose eksperimenter blev afsluttet.
1. Ekstraktion af mandibulære fortænder i en muse dental fluorose model
- Foder fluorfri diæt til C57BL/6-mus (5 uger gamle, handyr) fra 1 uge før fluor til ophør af fluorbehandling.
- Forbered fluorvand ved at tilsætte NaF i destilleret vand efterfulgt af vakuumfiltrering ved hjælp af et 0,2 μm filter. Dyr får fluorvand som NaF (0 ppm og 125 ppm; N=5/gruppe) ad libitum i 6 uger. Udskift fluorvand med en frisklavet batch hver 2. dag.
- Efter 6 ugers behandling med fluorvand aflives dyr med CO2 efterfulgt af halshugning.
- Uddrag hemi mandibular med forænder fra hver mus. For at samle hemi mandibular med snit, skære musklerne omkring mandibularkæben uden at anvende overdreven kraft.
- Anbring hemi mandibular i PBS og hold den ved 4 ° C indtil μ-CT-analyse (valgfrit). Adskil fortænderne fra mandibularen ved hjælp af en skalpel (# 15) og saks uden at beskadige eller bryde prøven.
- Vask den isolerede fortænder med PBS og udfør dehydrering ved at nedsænke den i stigende styrke af alkohol (70% og 100% ethanol) i 2-3 timer.
BEMÆRK: Hvis vævet (f.eks. Pulp) ikke er tilstrækkeligt dehydreret, vil harpiksimprægnering sandsynligvis blive hæmmet, og efterfølgende evaluering vil sandsynligvis være utilstrækkelig. - Efter dehydrering med ethanol indlejres snittet vandret i harpiks. Fortsæt til trin 3.
2. Ekstraktion af maksillære alveolære knogler i en museligatur-induceret periodontal knogleresorption (L-PBR) model
- Administrer 0,8 ml ketamin (100 mg / ml) + 0,1 ml xylazin (100 mg / ml) + 9,1 ml PBS intraperitonealt (i.p.) til mus (C57BL / 6, 8-12 uger gammel, han) som bedøvelsesmidler. Doseringen er 0,01 ml / g (vægt). Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Placer den bedøvede mus på en varmepude i 5-10 min. Vurder reaktioner på hale / tå klemmer og intaktheden af okulær refleks. Bekræft, at musen ikke reagerer på de skadelige stimuli, og refleksen er fraværende.
- Placer musen på behandlingsbriksen og hold munden åben ved hjælp af en ligatur 5-0 silkesutur bundet til en magnetisk stolpe på behandlingsbordet.
- Under et kirurgisk mikroskop vikles ligaturen (flettet silkesutur 6-0) rundt om den ene side af den maksillære anden molære (enkeltlag) ved hjælp af mikronåleholdere. Minimer individuelle forskelle i analyse ved at bruge den ene side som behandlingsside og den anden side som kontrol.
- Bind ligaturen og lav en knude på ganesiden. Efter at have lavet en knude, skær den resterende ligatur så kort som muligt, så den overdrevne ligatur ikke forstyrrer tygning eller spisning. Dette er vigtigt for at sikre, at ligaturen ikke løsnes ved tygning i den efterfølgende observationsperiode.
BEMÆRK: Efterlad ikke dyret uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Returner ikke dyret, der har gennemgået kirurgi, til selskab med andre dyr, før det er helt genoprettet. Oprethold sterile forhold under overlevelse. - Foder kost og vand til mus ad libitum i 2 uger. Efter 2 ugers ligering aflives mus med CO2 efterfulgt af halshugning.
- Udtræk begge side maxillae (ligatur side og kontrol side) med molarer fra hver mus. For at samle maxillae med molarer skal du skære musklerne og knoglen omkring den maksillære kæbe ved hjælp af en saks uden at anvende overdreven kraft. Hver maxilla anbringes i PBS, og den opbevares ved 4 °C indtil μCT-analyse (valgfrit).
- Adskil den alveolære knogle med kindtænder (1st til 3rd) fra maxillaen ved hjælp af en skalpel (# 15) og saks uden at beskadige eller bryde prøven.
- Vask den isolerede alveolære knogle med PBS, dehydrer og affedt derefter ved nedsænkning i stigende alkoholstyrke (70% og 100% ethanol) i 2-3 timer.
BEMÆRK: Hvis vævet (f.eks. Pulp og knogle) ikke er tilstrækkeligt dehydreret, vil harpiksimprægnering sandsynligvis blive hæmmet, og efterfølgende evaluering vil sandsynligvis være utilstrækkelig. - Efter dehydrering med ethanol indlejres den alveolære knogle vandret i harpiks. Fortsæt til trin 3.
- Valgfrit: Udfør μCT-evaluering før mikrohårdhedstest.
- Før mikrohardhedstest udføres ikke-destruktiv strukturel analyse (f.eks. μCT) ved hjælp af den samme prøve til mikrohardhedstest som en komplementær evaluering (figur 1). Strukturel information (3D-billede, mineraltæthed, volumen) af μCT kan understøtte evaluering af prøvemekaniske egenskaber og kvalitet, der kan påvirke mikrohårdhedsresultater.
Figur 1: Repræsentative μCT-billeder af emalje i kontrol- og fluorbehandlede musefortænder. (A) Repræsentativt μCT sagittalt billede af mandibulær fortand. (B-D) μCT koronale billeder af kontrolfortænder (NaF 0 ppm). (E-G) μCT koronale billeder af fortænder behandlet med NaF (125 ppm). Repræsentativ emaljemineraltæthed (EMD) er vist (g/cm3). Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Indlejring af prøver i harpiks
- Fortsæt fra trin 1.7 (dental fluorose model) eller trin 2.10 (L-PBR model).
- Overtræk indersiden af monteringskoppen (1 tomme) med et tyndt lag petrolatum. Bland harpiks (koldindstillingsindlejringsharpiks) i henhold til instruktionerne. Hæld harpiksen og hærderen i den medfølgende plastikkop i et volumenforhold på 15: 2 og bland forsigtigt med en træspatel i mindst 2 min. Undgå luftbobler.
- Anbring dehydreret og affedtet fortænder (figur 2A) eller alveolær knogle med molarer (figur 2B) orienteret vandret og parallelt med bunden af monteringskoppen (1 prøve pr. kop).
- Hæld den blandede harpiks (lige nok harpiks, ca. 1,5 ml) i monteringskoppen for helt at dække prøven. Undgå at tilføje mere harpiks end nødvendigt, da overskydende harpiks vil hæmme poleringsprocessen (figur 2C, D). Monteringskoppen med prøven anbringes på en varmeplade ved 50 °C i mindst 8 timer for at fremme harpikspolymerisation. Denne procedure bidrager til at holde prøven i en stabil position.
BEMÆRK: Afhængigt af prøvestørrelsen skal du justere mængden af harpiks for helt at dække prøven. Fyld ikke for meget harpiks, ellers er der brug for mere tid til at fjerne overflødig harpiks. - Efter hærdning fjernes harpiksen, der indeholder prøven, fra monteringskoppen. Fjern grater, og arranger prøvens plan og det modsatte sideplan som parallelt og fladt ved hjælp af en avanceret slibemaskine med groft vandafvisende slibepapir (Grit 60 / P60 og 120 / P120) under vandoversvømmelse. Hold prøvens højde på ca. 3 mm for fortænder og alveolær knogle (figur 2E, F).
BEMÆRK: Når prøven analyseres af SEM efter mikrohårdhedsmålingen, skal prøvens tykkelse være ca. 3 mm, så efterfølgende SEM-observation ikke påvirkes. Mindre prøver er sværere at manipulere med kværnen. For prøver, der kun er beregnet til mikrohårdhed, kan prøvehøjden øges til ca. 10-20 mm. - Trim den ydre form for at lave en rektangulær solid harpiksblok og runde hjørner (ca. bredde 30 mm, længde 10 mm til fortænder (figur 2G) og bredde 10 mm, længde 5 mm, til alveolær knogle (figur 2H)) ved hjælp af en præcisionssnitsav.
- Når den grove formkorrektion er afsluttet, skal du fjerne snavs og partikler fra harpiksblokken ved hjælp af en ultralydsrenser (ca. 1 min). Fortsæt til trin 4.
Figur 2: Flow af harpiksindlejring og polering. A) Dehydreret og affedtet fortand. (B) Dehydreret og affedtet alveolær knogle i L-PBR. (C, D) Incisors og alveolær knogle nedsænket i harpiks. (E, F) Ved at afskære harpiksen er det lettere at polere målvævets overflade. (G, H) Harpikshjørner afrundet til poleringsprocessen. Forkortelser: L-PBR = ligatur-induceret parodontal knogleresorption. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Polering af prøver
BEMÆRK: Polering af prøver udføres manuelt ved hjælp af vandtæt slibepapir (fra ru til finere) på en avanceret slibemaskine under vandoversvømmelse.
- Læg et groft vandafvisende slibepapir (Grit 600/P1200) på kværnen. Anbring den trimmede og rensede harpiksblok (fra trin 3.7) på det ru vandafvisende slibepapir.
- Mens du hælder vand, skal du holde harpiksblokken og polere prøvens evalueringsoverflade på slibemaskinens polermaskine (hastighed 1-10 x g). På dette tidspunkt skal du være forsigtig med at holde harpiksblokken, så evalueringsoverfladen er parallel med jorden. For at holde evalueringsoverfladen intakt skal du kontrollere overfladen med det blotte øje eller under et mikroskop.
BEMÆRK: Bemærk, at kværnen roterer med uret, og ensartet tryk kan føre til en overflade uden sidestykke. For at opnå en parallel overflade skal du holde svæveflyets rotationshastighed konstant og trykke forsigtigt på prøven i et par sekunder og derefter dreje prøven 180 ° for at trykke i samme tid. Groft slibepapir kan fjerne ikke kun harpiks, men også prøve. - Skift slibepapiret til Grit 800/P2400, og læg harpiksblokken på det. Gentag trin 4.2.
- Fjern snavs og partikler fra harpiksblokken ved hjælp af en ultralydsrenser (ca. 1 min).
BEMÆRK: Før du fortsætter, anbefales det at bruge en ultralydsrenser til at fjerne overfladeaffald for at forhindre tilstopning. - Udfør derefter seriel polering ved hjælp af finere slibepapir; Poleringsrækkefølgen er 12 μm, 9 μm, 3 μm, 1 μm og 0,3 μm.
- Placer en lapfilm (12 μm) på slibemaskine-polerbordet uden rotation, og læg harpiksblokken på lapfilmen.
BEMÆRK: I dette eksperiment er kværnbordet egnet til at få en flad overfladetilstand under vandoversvømmelse. Alternativt kan et stort plan spejl (eller lignende), der giver parallelisme, også bruges. - Under vandkøling poleres forsigtigt prøvens evalueringsoverflade på lapfilmen manuelt. Flyt prøven lodret, vandret og diagonalt i det samme antal sekunder under vandinjektion med slag på 2 til 3 cm (1 tomme). Når poleringsproceduren er korrekt opnået, klæber harpiksprøven til lapfilmen.
- Fjern snavs og partikler som i trin 4.4. Skift slibepapiret til den næste størrelse i henhold til den serielle poleringsrækkefølge (fra 12 μm til 0,3 μm), og læg harpiksblokken på den.
- Mens du hælder vand, skal du holde harpiksblokken og polere forsigtigt prøvens overflade på lapfilmen med hånden. Fjern snavs og partikler som i trin 4.4.
- Gentag trin 4.5 - 4.8 for at fuldføre den endelige polering (0,3 μm). Efter afslutningen af den endelige polering (0,3 μm) skal prøven have en spejlfinishoverflade (figur 3A).
- Rengør overfladen af prøven med ethanol (100%) for at affedte og dehydrere og opbevare harpiksblokke ved stuetemperatur indtil mikrohårdhedstest. Undgå overdreven fugt og støv under opbevaring. Fortsæt til trin 5.
5. Vickers mikrohardhedstest
BEMÆRK: Indrykning af en spejlfinishoverfladeprøve udføres ved hjælp af en mikrohardhedstester. Testning udføres med en belastning på 25 g i 10 s med en Vickers-spids.
- Vickers mikrohardhedstest for fortænder (dental fluorose model)
BEMÆRK: Emalje kan opdeles i tre lag udefra (mundhuleside) til inderside (papirmasseside); nemlig det overfladiske lag, mellemlaget og det dybe lag (dentin-emalje-krydset, DEJ) (figur 3B)16. I denne protokol testes tre emaljelag.- Indstil belastningskraften til 25 g og belastningsvarigheden til 10 s. Placer harpiksblokken på scenen.
- Indrykning 6 punkter i hvert emaljelag (overfladisk, mellem og DEJ) og dentin i hver region (livmoderhals, midterste og spids; Figur 3B).
- Mål længden af de to diagonaler (d1 og d2; Figur 3B) at beregne Vickers mikrohårdhedsværdi (HV; Figur 4).
- Vickers mikrohårdhedstest for alveolær knogle (L-PBR model)
- Indstil belastningskraften til 25 g og belastningsvarigheden til 10 s. Placer harpiksblokken på scenen.
- Indryk 3-6 punkter i hver mesial og distal side af alveolær knogle fra den alveolære kam. Indrykning alveolære knogler mellem 1st og 2nd molær (hvid firkant), og 2nd og 3rd molar.
BEMÆRK: I denne protokol blev 6 punkter i hver mesial og distale side (i alt 12 point) evalueret for kontrolknoglen (intakt), og 3 punkter i hver side (i alt 6 point) blev evalueret for L-PBR. Antallet af indrykningspunkter afhænger af læsionens betingelser (f.eks. For meget knogletab begrænser fordybningsområdet).
Figur 3: Evalueringsområder af mikrohardhed i mandibulær fortand. (A) Spejloverfladeprøve indeholdende mandibulær fortand. B) indrykninger i hver region livmoderhals, mellem og spids (NaF 0 ppm). C) Tre emaljelag fra DEJ, indre, mellem og ydre emalje. Forkortelser: D = dentin, E = emalje, DEJ = dentin emalje kryds Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vickers mikrohårdhed af emalje behandlet med eller uden NaF. Mikrohårdheden af dentin og tre emaljelag blev evalueret i hver region, livmoderhals-, mellem- og spidsregion. (A-C) Kontrol og (D-F) NaF (125 ppm) behandling. Data præsenteres som gennemsnit ± SD. Signifikante forskelle blev evalueret ved envejs ANOVA med Tukeys post-hoc test. P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. **p < 0,005, ***p < 0,0005, ****p < 0,0001 Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dental fluorose model: Figur 1 viser repræsentative μCT billeder af fortænder i kontrol og fluoridbehandlede mus. I kontrollen (figur 1B-D) viste livmoderhalsområdet lavere emaljemineraltæthed (EMD) på 1,188 g / cm3 (figur 1B) sammenlignet med midten (1,924 g / cm3) og spidsen (1,819 g / cm3; Figur 1C,D). I den fluoridbehandlede emalje (figur 1E-G) blev kun én prøve ud af fem evalueret for EMD i livmoderhalsregionen (0,835 g/cm3; Figur 1E og supplerende figur 1). EMD i alle regioner faldt sammenlignet med kontrollen (figur 1F,G). De lave EMD-niveauer var i overensstemmelse med de lave emaljemikrohårdhedsværdier. Som vist i figur 3 blev seks punkter indrykket ved dentin og tre lag emalje (indre, midterste og ydre) i livmoderhals-, midter- og spidsregionerne. I kontrollen var hvert emaljelags mikrohårdhed lavere end dentin i livmoderhalsområdet (figur 4A). I de midterste og spidse regioner var emaljemikrohårdheden af hvert lag signifikant højere end dentin (figur 4B, C). Blandt de tre emaljelag steg mikrohårdheden fra den indre til den ydre emalje i hvert midterste og spidsområde (figur 4B, C). Dentin havde en mikrohårdhedsværdi omkring 100 HV med små variationer i cervikal-, mellem- og spidsregioner, mens emaljemikrohårdhed var signifikant forskellig i regioner og i emalje tre lag. Disse resultater tyder på, at emaljemikrohardhed varierer signifikant afhængigt af indrykningssteder (regioner og emaljelag). I den fluorbehandlede tand var emaljemikrohardheden i modsætning til kontrollen mindre end dentin, selv i det midterste område (figur 4E). I spidsområdet faldt mikrohårdheden signifikant fra det indre til det ydre emaljelag (figur 4F). Disse gradientforskelle i mikrohårdhed blandt emaljelag er vanskelige at evaluere ved μCT-billeder.
L-PBR-model: Figur 5A viser μCT-billeder af alveolær knogle i ligatur-induceret periodontal knogleresorption (L-PBR) model. Den repræsentative knoglemineraltæthed (BMD) (gennemsnit af mesial og distale sider af alveolær knogle omkring anden molar) var 0,76 g / cm3 i kontrolben og 0,61 g / cm3 i L-PBR. Knogleresorptionsniveauer blev kvantificeret ved afstanden fra cementemaljeforbindelsen (CEJ) til den alveolære knoglekam (ABC). CEJ-ABC-længden var signifikant øget i L-PBR sammenlignet med kontrolknoglen (figur 5B). Figur 6 viser mikrohårdhedsindrykningssteder og tilsvarende μCT-billeder. Fra den alveolære knoglekam blev der udført fem fordybninger i hver medial og distal side (i alt 10 steder) i kontrolknoglen mellem 1. og 2. molær angivet med den hvide firkant (figur 6A). De 3 fordybninger i hver mesial og distale side (i alt 6 steder) blev målt i L-PBR (figur 6B). Vickers mikrohårdhedsværdier (HV) var middelværdierne for fordybninger af alveolære knogler mellem 1. og 2. molære (figur 6B; Hvid firkant), og mellem 2. og 3. molær (figur 6B; Blå firkant). Alveolære BMD- og HV-knogleværdier viste en lavere tendens i L-PBR (påvirket af periodontale sygdomme) sammenlignet med kontrol (sund) alveolær knogle.
Figur 5: Repræsentativt μCT-billede og knogletab i L-PBR-modellen. (A) Repræsentative μCT-billeder i L-PBR-modellen (kontrol- og L-PBR-gruppe). Den repræsentative knoglemineraltæthed (BMD; gennemsnit af mesial og distale sider af alveolær knogle omkring anden molar) er vist (g / cm3). (B) Afstand fra mesial og distal CEJ af den maksillære anden molære til den alveolære knoglekam i roden apikale retning. Data præsenteres som gennemsnit ± SD. Signifikante forskelle blev evalueret ved t-test. P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. p < 0,0001. Forkortelser: L-PBR = ligatur-induceret parodontal knogleresorption. CEJ = cementemalje kryds, ABC = alveolær knoglekam. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentativ mikrohårdhed resulterer i L-PBR-modellen. Repræsentativ bukkal side af fordybningssteder (venstre) og det tilsvarende μCT-billede (højre) af (A) kontrolalveolær knogle og (B) L-PBR. Hvide firkanter viser fordybningsområder i den alveolære knogle mellem M1 og M2. Blå firkanter viser fordybningsområder i den alveolære knogle mellem M2 og M3. Mikrohårdhedsværdier (HV) er midlerne til fordybninger i hvide og blå firkantede områder. M1: 1. kindtand , M2: 2. kindtand , M3: 3. kindtand . Forkortelser: L-PBR = ligatur-induceret parodontal knogleresorption. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: μCT-billede af emalje behandlet med NaF (koronal sektion). NaF (125 ppm) forårsagede emaljehypomineralisering, hvilket blev signifikant observeret i livmoderhals- og mellemregionerne. Kun en prøve (prøve nr. 1) ud af fem viste næppe emalje i livmoderhals- og mellemregionerne. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrohardhed udføres for at evaluere mekaniske egenskaber af hårdt væv som tand og knogler. Til dato er der rapporteret om divergerende mikrohårdhedsmålemetoder. De fleste måleoplysninger, især prøvepræparater og indrykningssteder, vil sandsynligvis være utilstrækkelige. Denne undersøgelse fokuserede på mikrohårdhedsprotokollen for emalje og alveolær knogle i modeller for dental fluorose og periodontale sygdomme. For at opnå konsistente og nøjagtige resultater er de kritiske trin i denne protokol orientering af prøven i harpiksindlejring, fastholdelse af evalueringsoverfladen parallelt med jorden, seriel polering af evalueringsoverfladen for at opnå spejlfinish og indrykningsregioner og steder indstillet efter referencepunkt. Under harpiksindlejrings- og poleringsprocedurerne er det vigtigt at kontrollere, at evalueringsoverfladen konsekvent er parallel med jorden, og at overfladen er intakt med øjet eller under et mikroskop. Selvom det er valgfrit, opfordres μCT-analyse til at bestemme indrykningssteder.
I dental fluorosemodellen gjorde NaF (125 ppm) behandling det vanskeligt at identificere emaljestruktur fra livmoderhals- til mellemregionerne ved μCT. Kun emaljen i spidsområdet kunne skelnes fra dentin (figur 1 og supplerende figur 1). For at evaluere emaljemikrohardhed i dental fluorosemodellen er spidsregionens fordybning derfor passende. I overensstemmelse hermed evaluerede tidligere undersøgelser spidsområdet for fortandemaljen i dental fluorosemodeller 6,7. I periodontal sygdomsmodellen hjælper 3D-observation med μCT med at identificere knogleresorptionen på både bukkale og palatale sider (figur 5). Dette er afgørende for at forstå mængden af knogletab og den alveolære knogles anatomiske position for at bestemme konsistente fordybningssteder for mikrohårdhed.
En tidligere undersøgelse viste en positiv sammenhæng mellem mikrohardhed og mineraltæthed17. Vores resultater af EMD ved μCT og emaljemikrohardhed (HV; Figur 1 og figur 4) er i overensstemmelse med undersøgelsen. Disse resultater tyder på, at den omtrentlige tendens til mikrohardhed kan forudses ved μCT ikke-destruktivt. Imidlertid er gradientmikrohårdhedsforskellene mellem emaljens tre lag (figur 4B, C, F) vanskelige at identificere som EMD-gradienter ved μCT-analyse. I denne henseende kan mikrohardhedstest betragtes som højere opløsning end μCT for at afklare patologiske tilstande. Denne protokol kan også anvendes på andre tandhårde væv, herunder dentin. Ved hjælp af den samme prøve kan mangefacetteret evaluering (SEM, SEM-EDX, micro-XRF og Raman-spektroskopi) inkorporeres i det eksperimentelle flow før mikrohårdhedsindrykninger18. Da fordybninger beskadiger prøver, skal du starte med en ikke-destruktiv test.
En af de kritiske begrænsninger ved mikrohårdhedstest er, at værdien har tendens til at blive påvirket af flere faktorer under prøveforberedelse og indrykning. For at minimere subjektive faktorer er det nødvendigt at optimere indrykningssteder og standardisere måleprotokoller, der passer til hver patologisk tilstand eller sygdomsmodel. I denne undersøgelse demonstrerede vi en emaljemikrohardhedsprotokol for en dental fluorosemodel. Imidlertid kan modifikation og / eller optimering af protokollen være nødvendig for anden emaljehypoplasi, fx amelogenesis imperfecta (AI) model, fordi patologi adskiller sig i hver sygdomsmodel. I periodontal sygdomsmodellen er alveolær knogle det vigtigste målvæv. L-PBR-modeller er yderst anvendelige med hensyn til anvendelse af genetiske modifikationsteknikker i mus. Til dato er mange undersøgelser af L-PBR-modeller blevet offentliggjort 19,20 . Men så vidt vi ved, har ingen af undersøgelserne nogensinde behandlet mikrohardhed af alveolær knogle i museparodontale sygdomsmodeller. Dette kan tilskrives flere faktorer. Forholdet mellem alveolær knoglemikrohardhed og periodontal sygdom er endnu ikke klart. Mikrohårdhedstesten er teknisk vanskelig at udføre i musens alveolære knogle, især i knogleresorptionslæsioner (på grund af vanskeligheder med at indstille indrykningssteder på grund af knogleødelæggelse). Det er rimeligt at antage, at sidstnævnte er den faktor, der er årsag til, at mikrohårdhed ikke er blevet evalueret i paradentosesygdomsmodeller, på trods af at mikrohårdhedsværdien er valideret som en mekanisk parameter i lårben og andre knogler21. Denne standardiserede protokol kan evaluere de mekaniske egenskaber af alveolær knogle, der er påvirket af periodontal sygdom og / eller sygdomsgendannelsesmodel.
I denne rapport demonstrerer vi den standardiserede protokol til evaluering af emalje og alveolær knoglemikrohardhed i en oral sygdomsmodel med mus. Dette åbner døren for fremtidig evaluering af emalje og periodontalt knogletab / regenerering for at udvikle nye forebyggende og terapeutiske strategier for emaljemisdannelser og periodontal sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) og National Institute of General Medical Sciences; T34GM145509 (MM) og National Institute of Dental and Craniofacial Research; R01DE025255 og R21DE032156 (XH) R01DE029709, R21DE028715 og R15DE027851 (TK) R01DE027648 og K02DE029531 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | ||
| Canica Small Animal Surgery System | Kent Scientific Corporation | SURGI 5001 | |
| CarbiMet PSA 120/P120 | Buehler | 30080120 | |
| CarbiMet PSA 60/P60 | Buehler | 36080060 | |
| CarbiMet PSA 600/P1200 | Buehler | 36080600 | |
| Castroviejo Micro Needle hilder | F.S.T | 12060-01 | |
| Epofix cold setting embeding Resin | Electron Microscopey Science | CAT-1237 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Brand | FB11201 | |
| Fluoride-free Rodent diet | Bio Serv | F1515 | AIN-76A, 1/2" Pellets |
| in-vivo microCT Skyscan 1176 | Bruker | ||
| Isomet 1000 Precison saw | Buehler | MA112180 | |
| Lapping film 0.3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4203 | Alternative A3-0.3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 1µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4206 | Alternative A3-1 SHT, 3M USA |
| Lapping film 12µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4211 | Alternative A3-12 SHT, 3M USA |
| Lapping film 3µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4204 | Alternative A3-3 SHT, 3M USA |
| Lapping film 9µm | Maruto instrument co, LTD. Japan | 26-4201 | Alternative A3-9 SHT, 3M USA |
| Leica wild microscope | Leica | LEIC M690 | |
| Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisher | Buehler | No: 557-MG1-1160 | |
| MicroCut PSA 1200/P2500 | Buehler | 36081200 | |
| MicroCut PSA P4000 | Buehler | 36084000 | |
| Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z | PACE Technologies | ||
| SamplKups 1 inch | Buehler | No: 209178 | |
| Sodium Fluoride | Fisher Scientific | S299-100 | |
| West cott Stitch Scissor | JEDMED | Cat. #25-1180 | |
| ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H) | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
- Broitman, E. Indentation hardness measurements at macro-, micro-, and nanoscale: A critical overview. Tribol Lett. 65 (1), 23 (2017).
- Lee, M. J., et al. Sirt6 activation ameliorates inflammatory bone loss in ligature-induced periodontitis in mice. Int J Mol Sci. 24 (13), 10714 (2023).
- Min, J., et al. Investigation on the gradient nanomechanical behavior of dental fluorosis enamel. Nanoscale Res Lett. 13 (1), 347 (2018).
- Craig, R. G., Peyton, F. A. The micro-hardness of enamel and dentin. J Dent Res. 37 (4), 661-668 (1958).
- Chun, K., Choi, H., Lee, J. Comparison of mechanical property and role between enamel and dentin in the human teeth. J Dent Biomech. 5, (2014).
- Suzuki, M., Everett, E. T., Whitford, G. M., Bartlett, J. D. 4-phenylbutyrate mitigates fluoride-induced cytotoxicity in alc cells. Front Physiol. 8, 302 (2017).
- Sharma, R., et al. Assessment of dental fluorosis in mmp20 +/- mice. J Dent Res. 90 (6), 788-792 (2011).
- Wu, W. W., et al. Bone hardness of different anatomical regions of human radius and its impact on the pullout strength of screws. Orthop Surg. 11 (2), 270-276 (2019).
- Li, S., et al. Atlas of human skeleton hardness obtained using the micro-indentation technique. Orthop Surg. 13 (4), 1417-1422 (2021).
- Ibrahim, A., et al. Hardness an important indicator of bone quality, and the role of collagen in bone hardness. J Funct Biomater. 11 (4), 85 (2020).
- Vandana, K. L., Srishti Raj, B., Desai, R. Dental fluorosis and periodontium: An original research report of in vitro and in vivo institutional studies. Biol Trace Elem Res. 199 (10), 3579-3592 (2021).
- Xia, P. F., et al. Microcarriers containing "hypoxia-engine" for simultaneous enhanced osteogenesis and angiogenesis. Chemical Engineering Journal. 456, 141014 (2023).
- Chiu, R., et al. Effects of biglycan on physico-chemical properties of ligament-mineralized tissue attachment sites. Arch Oral Biol. 57 (2), 177-187 (2012).
- Leong, N. L., et al. Age-related adaptation of bone-pdl-tooth complex: Rattus-norvegicus as a model system. PLoS One. 7 (4), e35980 (2012).
- Johnson, W. M., Rapoff, A. J. Microindentation in bone: Hardness variation with five independent variables. J Mater Sci Mater Med. 18 (4), 591-597 (2007).
- Kweon, Y. S., et al. Effects of fam83h overexpression on enamel and dentine formation. Arch Oral Biol. 58 (9), 1148-1154 (2013).
- Boivin, G., et al. The role of mineralization and organic matrix in the microhardness of bone tissue from controls and osteoporotic patients. Bone. 43 (3), 532-538 (2008).
- Okamoto, M., et al. Microstructural evaluation of the mineralized apical barrier induced by a calcium hydroxide paste containing iodoform: A case report. J Endod. 2 (2), 243-251 (2024).
- Wang, Y., et al. B10 cells alleviate periodontal bone loss in experimental periodontitis. Infect Immun. 85 (9), e00335 (2017).
- Chen, Y., et al. Nlrp3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation. Cell Prolif. 54 (2), e12973 (2021).
- Robinson, J. W., et al. Male mice with elevated c-type natriuretic peptide-dependent guanylyl cyclase-b activity have increased osteoblasts, bone mass and bone strength. Bone. 135, 115320 (2020).
