في المختبر والمجراة في ضوء بارد مراسل التصوير الجيني للخلايا منشأ جنينية بشرية
Summary
مع تزايد الاهتمام في علاجات الخلايا الجذعية ، وتقنيات التصوير الجزيئي مثالية لمراقبة سلوك الخلايا الجذعية بعد الزرع. وقد مكنت الجينات مراسل Luciferase غير الغازية ، وتقييم المتكررة لبقاء الخلية ، والموقع ، وانتشارها في الجسم الحي. وهذا الفيديو لشرح كيفية تعقب انتشار hESC في ماوس المعيشة.
Abstract
وزاد اكتشاف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل كبير من الأدوات المتاحة لعلماء الطب المهتمين في مجال الطب التجديدي. ومع ذلك ، الحقن المباشر للhESCs ، وخلايا متباينة من hESCs ، في الكائنات الحية وقد تم حتى الآن يعوقها موت الخلايا كبيرة ، وتشكيل مسخي ، ورفض استضافة المناعي. فهم في السلوك hESC المجراة بعد زرع يتطلب تقنيات التصوير الرواية لرصد توطين hESC طوليا ، والانتشار ، وقدرتها على البقاء. وقد أعطى المحققين التصوير الجزيئي وسيلة عالية الإنتاجية ، وغير مكلفة ، وحساسة لتعقب انتشار الخلايا في الجسم الحي خلال الأيام والأسابيع وحتى أشهر. وقد زاد هذا التقدم بشكل كبير في فهم حركية المكانية والزمانية لمن engraftment hESC ، والانتشار ، وتشكيل مسخي ، في الموضوعات الحية.
وثمة تقدم كبير في مجال التصوير الجزيئي على تمديد موسع فحوصات الجينات مراسل من البيولوجيا الجزيئية والخلوية في التصوير منصات متعددة في الجسم الحي الطريقة. هذه الجينات المراسل ، تحت سيطرة المروجين وهندستها القدرة على أن الاستفادة من آلية الخلية المضيفة ليالي النسخي ، يتم إدخالها في الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من أساليب ناقلات وغير الموجه. مرة واحدة في الخلية ، ويمكن جينات كتب مراسل constitutively إما أو فقط تحت ظروف محددة أو البيولوجية الخلوية ، اعتمادا على نوع من المروج المستخدمة. ثم يتم الكشف عن النسخ والترجمة من الجينات إلى بروتينات مراسل النشطة بيولوجيا مع الأجهزة وحساسة موسع (مثل كاميرات CCD) باستخدام إشارة المولدة للتحقيقات مثل مد luciferin.
لتجنب الحاجة للضوء مثير لتعقب الخلايا الجذعية في الجسم الحي كما هو مطلوب من أجل التصوير مضان ، تلألؤ بيولوجي نظم التصوير الصحفي الجين تتطلب تحقيقا خارجيا فقط تدار للحث على انبعاث الضوء. يراعة luciferase ، المستمدة من البرالس Photinus يراعة ، وهو الانزيم الذي يقوم بترميز يحفز D – luciferin إلى oxyluciferin ، المستقلب نشطة ضوئيا. ويمكن عندئذ أن تراقب النشاط البصري مع كاميرا CCD الخارجية. transduced ستابلي الخلايا التي تحمل الحمض النووي داخل مراسل بناء على الكروموسومات سيمر مراسل بناء الحمض النووي للخلايا ابنته ، والسماح لرصد الطولي للبقاء والانتشار hESC في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، لأنه مطلوب للتعبير مراسل الجين المنتج لتوليد الإشارات ، وقابلة للحياة الوالد وابنته الوحيدة الخلايا إنشاء إشارة تلألؤ بيولوجي ؛ الخلايا أفكارك أو ميتا لن.
في هذا الفيديو ، سيتم وصف المواد والأساليب المحددة اللازمة لتعقب وقف تكاثر الخلايا وتكوين مسخي مع التصوير تلألؤ بيولوجي.
Protocol
Discussion
بالمقارنة مع وسائل أخرى مثل PET والتصوير بالرنين المغناطيسي ، وتلألؤ بيولوجي القرار المكاني المحدود وخفض اختراق الأنسجة نتيجة لضعف الطاقة نسبيا من الفوتونات (2-3 فولت) لهذه الأسباب أنها حتى الآن لم يتم تطبيق في الحيوانات الكبيرة. ومع ذلك ، تلألؤ بيولوجي لديها ميزة كونها منخفضة ال?…
Acknowledgements
بفضل تيم دويل ، دكتوراه ، ومركز ستانفورد للتصوير في الجسم الحي للحصول على المساعدة مع التصوير تلألؤ بيولوجي. أيضا بفضل هوانغ نغان ، دكتوراه لتقاسم تقنية الخلايا الجذعية لها على المشاركة في الحقن بمحلول المصفوفة. أخيرا ، بفضل ستيف فيلت ، دكتوراه للحصول على مساعدة رعاية الحيوانات البيطرية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17 (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. . Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , .
