In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines
Summary
Avec l'intérêt croissant pour les thérapies de cellules souches, des techniques d'imagerie moléculaire sont idéales pour le comportement des cellules souches de surveillance après la transplantation. Gènes rapporteurs luciférase ont permis non invasive, l'évaluation répétitive de la survie cellulaire, l'emplacement et la prolifération in vivo. Cette vidéo vous montrera comment suivre la prolifération des CSEh dans une souris vivante.
Abstract
La découverte de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) a considérablement augmenté les outils disponibles pour les scientifiques médicaux s'intéressent à la médecine régénérative. Cependant, l'injection directe de CSEh, et les cellules différenciées de CSEh, dans les organismes vivants n'a jusqu'ici été entravée par la mort cellulaire importante, la formation de tératome, et le rejet immunitaire de l'hôte. Comprendre le comportement en CSEh in vivo après transplantation nécessite des techniques d'imagerie pour suivre longitudinalement la localisation de CSEh, la prolifération et la viabilité. L'imagerie moléculaire a donné enquêteurs un moyen à haut débit, peu coûteux et sensibles pour le suivi de la prolifération cellulaire in vivo sur plusieurs jours, semaines, voire des mois. Ce progrès a considérablement augmenté la compréhension de la cinétique spatio-temporelle de la greffe de CSEh, la prolifération et tératome-formation chez des sujets vivants.
Une avancée majeure dans l'imagerie moléculaire a été l'extension de la non-invasive des dosages gène rapporteur de la biologie moléculaire et cellulaire dans les plates-formes d'imagerie in vivo la multi-modalité. Ces gènes rapporteurs, sous contrôle de promoteurs d'ingénierie et exhausteurs qui tirent parti de la machinerie transcriptionnelle de la cellule hôte s, sont introduits dans les cellules en utilisant une variété de méthodes vectorielles et non vectorielles. Une fois dans la cellule, les gènes rapporteurs peuvent être transcrits soit de manière constitutive, ou seulement sous certaines conditions biologiques ou cellulaire, en fonction du type de promoteur utilisé. La transcription et la traduction des gènes rapporteurs dans les protéines bioactives est ensuite détecté grâce sensibles, l'instrumentation non invasive (par exemple, caméras CCD) à l'aide de signaux générant des sondes telles que D-luciférine.
Afin d'éviter le besoin de lumière excitatrice pour suivre in vivo les cellules souches est aussi nécessaire pour l'imagerie de fluorescence, bioluminescence systèmes d'imagerie du gène rapporteur exigent seulement une sonde exogène administrée pour induire une émission de lumière. Luciférase de luciole, dérivé de la pyralis firefly Photin, code pour une enzyme qui catalyse D-luciférine le métabolite actif optiquement, oxyluciférine. Activité optique peut alors être contrôlé avec une caméra CCD externes. Stablement transduites cellules qui transportent le journaliste de construire au sein de leur ADN chromosomique va passer le journaliste construction d'ADN à des cellules filles, permettant un suivi longitudinal de la survie et la prolifération des CSEh in vivo. Par ailleurs, parce que l'expression du produit du gène rapporteur est requis pour la génération du signal, seule solution viable cellules mère et fille, va créer le signal de bioluminescence; cellules apoptotiques ou morts ne sera pas.
Dans cette vidéo, les matériaux spécifiques et les méthodes nécessaires pour la prolifération des cellules souches de suivi et de formation de tératome avec l'imagerie par bioluminescence seront décrites.
Protocol
Discussion
Comparé à d'autres modalités telles que la TEP et l'IRM, la bioluminescence a limité la résolution spatiale et la pénétration tissulaire réduite en raison de l'énergie relativement faible de photons émis (2-3 eV); pour ces raisons, il n'a jusqu'ici pas été applicables dans les grands animaux. Toutefois, la bioluminescence a l'avantage d'être à faible coût et à haut débit, et non invasive, ce qui rend hautement souhaitable pour les cellules souches in vivo de suivi dans les petits animaux. Gènes …
Acknowledgements
Merci à Tim Doyle, PhD, et le Centre Stanford pour l'imagerie in vivo pour l'aide à l'imagerie par bioluminescence. Merci aussi à Ngan Huang, PhD pour le partage de sa technique sur les cellules souches co-injection avec une solution de la matrice. Enfin, grâce à Steve Felt, Ph.D. pour l'aide aux soins des animaux à usage vétérinaire.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | HyClone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | StemCell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth AG | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | TPP | 92006 |
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