면역 스테인링을 위한 고정 Drosophila Oocytes의 준비: 외부 멤브레인을 수정하고 제거하는 고처리량 방법

- 마취 된 Drosophila를 작은 조각으로 분해하는 블렌더의 버퍼와 함께 펄스로 시작합니다.

더 작은 메쉬를 사용하여 이 과정을 반복하여 추가 이물질을 제거합니다.

그런 다음 PBS로 고정을 씻어 내고 난모세포를 염색하고 보호 외부 멤브레인을 제거하여 항체 침투를 허용합니다.

실시예 프로토콜에서, 우리는 척추 장치를 얼룩지게하고 시각화하기 위해 메이오시스 I에서 난모세포를 준비할 것이다.

- 시작하려면 5 밀리리터 튜브와 파스퇴르 파이펫의 내부를 PTB로 미리 잘라 표면에 달라붙는 난피테를 방지합니다.

결과 슬러리를 약 1500 마이크로미터의 모공을 가진 큰 메쉬를 통해 250 밀리리터 비커로 필터링합니다.

코팅된 파이펫에 추가 버퍼를 사용하여 첫 번째 비커를 헹구면 나머지 난소줄기를 수집합니다. 슬러리가 3분 동안 정착한 다음 하단 10 밀리리터를 제외한 모든 것을 흡입하십시오.

슬러리 10 밀리리터의 나머지 부분을 추가하고 액체를 제거하기 전에 믹스가 다시 정착하게하십시오. 코팅 된 파이펫에 추가 버퍼를 사용하여 비커에서 남은 난소 세포가 헹구십시오.

난소를 해결하기 위해 먼저 조직에서 모든 액체를 흡입하고 즉시 1 밀리리터의 수정 믹스를 추가합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 헵탄을 넣고 튜브를 1분 동안 소용돌이치고, 난소세포가 1분 동안 정착하도록 허용합니다.

정착된 조직에서 모든 액체를 제거한 다음 1x PBS의 밀리리터 1밀리리터를 추가한 다음 튜브를 30초 동안 돌이킨 다음, 난소세포가 1분 동안 정착하도록 허용합니다.

코팅 된 파이펫을 사용하여, 서리가 내린 유리 슬라이드에 약 500 ~ 1,000 oocytes를 추가합니다.