A separação automática de C. elegans Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar as contribuições da colonização e seus danos associados ao início das respostas imunes inatas na elegância do mar. Isso é conseguido expondo uma população sincronizada de adultos jovens à pseudomonas arosa expressando proteína fluorescente verde ou GFP, que produz uma população de vermes colonizados de forma variável pelo patógeno. Depois de lavar diferencialmente, as populações colonizadas de vermes são separadas em populações puras com foco nos dois extremos de vermes totalmente colonizados e não colonizados.

Em seguida, o RNA é extraído dessas populações e a expressão gênica imune é avaliada em comparação com vermes cultivados em E. coli não patogênica. A fim de examinar a relação entre a resposta imune e a colonização, os resultados são obtidos para mostrar que a resposta imune inata da elegância do mar à p arosa pode ser dissociada da colonização do patógeno. A principal vantagem dessa técnica sobre outras abordagens para estudar o início da resposta imune na elegância do mar é que ela aborda a variabilidade na infecção em populações quentes, permitindo-nos separar diferentes aspectos do processo de infecção.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na elegância do mar, imunidade inata, como qual é a base para o início das respostas imunes inatas e de uma maneira de alto rendimento. Qual é o impacto de diferentes manipulações genéticas ou ambientais na capacidade de resistir à colonização de patógenos? Para começar a cultivar vermes em vários nematóides, meio de crescimento ou placas NGM semeadas com bactérias E coli até que muitos vermes atinjam o estágio grave.

Em seguida, trate os animais graves com solução de preparação de ovos para obter uma cultura sincronizada. Próximo prato. Os ovos em várias placas NGM de 60 milímetros semeadas com bactérias a uma densidade de aproximadamente 150 a 200 ovos por placa.

Um mínimo de 15 a 20 placas será necessário para obter vários milhares de vermes. Para o experimento de classificação, os usuários devem aumentar a escala usando placas de diâmetro maior com mais ovos por placa, se for necessário um número maior de minhocas. Incube as placas a 20 graus Celsius por dois dias até que os vermes atinjam o estágio L quatro ou adulto jovem.

No dia seguinte à preparação do ovo, inocule A GFP expressando a cultura POSA, PA 14 GFP, em dois mililitros de reis B.Medium contendo antibiótico. Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação durante a noite. No dia seguinte, coloque a cultura PA 14 GFP em quantas placas de morte lenta forem necessárias para o ensaio em cada placa de Petri de 150 milímetros.

Pipete 75 a 100 microlitros de cultura saturada e espalhe uniformemente. Usando um espalhador de vidro estéril, incube as placas a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas. Remova as placas com PA 14 GFP da incubadora e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente.

Enquanto isso, para coletar os vermes cultivados em placas NGM, adicione uma pequena quantidade de tampão M nove suficiente para cobrir a placa. Agite suavemente a placa e transfira o líquido para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe as minhocas assentarem no fundo e remova o excesso de líquido antes de transferi-las para placas PA 14 GFP Em um volume mínimo de líquido, ao usar placas de 150 milímetros, várias centenas de minhocas podem ser colocadas em uma única placa.

Incube as placas a 25 graus Celsius por 18 a 21 horas para vermes adultos jovens expostos a p arosa. Esta é a janela de tempo que exibe a distribuição ideal de animais colonizados versus não colonizados antes de realizar a classificação da amostra para garantir que a máquina esteja funcionando corretamente. As etapas essenciais são descritas aqui e os detalhes podem ser obtidos online.

Defina a pressão da válvula da bainha para aproximadamente cinco PSI para verificar se a taxa de fluxo do fluido da bainha é apropriada. Coloque um tubo cônico de 15 mililitros abaixo do dispensador. Ligue a válvula de bainha e desligue a válvula classificadora.

Segure o tubo embaixo do dispensador por 60 segundos. O volume no tubo deve ser de nove a 10 mililitros. Se estiver fora desse intervalo.

Ajuste a pressão da válvula da bainha de acordo para garantir que a taxa de fluxo do fluido da bainha permita uma classificação precisa. Teste a taxa de classificação desligando primeiro a válvula de bainha. Em seguida, adicione cerca de 25 mililitros de solução de partícula de controle ao reservatório.

Ligue a válvula de bainha e a válvula de amostra no software do computador. Navegue até o modo de partícula de controle e clique em adquirir. Certifique-se de que a taxa de fluxo de partículas seja de aproximadamente cinco a oito partículas por segundo, com o tempo de voo se aproximando da largura da partícula de 40 micrômetros.

Isso garantirá que apenas um único objeto de 40 mícrons esteja passando por vez. Se os valores estiverem fora desse intervalo, ajuste as configurações de acordo. Usando M nove minhocas, lave as minhocas em tubos cônicos de 15 mililitros, permita que as minhocas adultas afundem no fundo do tubo por gravidade e remova o sobrenadante.

Encher o tubo com tampão M nove fresco. Repita esse processo três a quatro vezes. Isso remove uma grande proporção de larvas, bem como o excesso de bactérias, e leva cerca de 10 minutos.

Adicione minhocas ao reservatório do classificador de minhocas contendo uma pequena barra de agitação de mistura suave. Ajuste o ganho inicial do sinal definindo o tubo fotomultiplicador verde para 600 e o tubo fotomultiplicador vermelho e amarelo para 200. Comece a adquirir dados para ajustar as configurações.

Apontar para uma taxa de classificação de 25 a 30 eventos ou worms por segundo. Se a taxa numérica for muito alta, dilua as minhocas no reservatório com M nove. Buffer de acordo.

Se a taxa for muito baixa, adicione mais minhocas em um pequeno volume de M nove. Se o experimento exigir uma separação muito rigorosa de vermes colonizados versus não colonizados, defina o teste de coincidência como puro. Isso garante que, se dois objetos ocorrerem muito próximos um do outro ou na mesma queda, a máquina rejeitará a queda.

Em vez de coletá-lo para classificar a população de interesse, desenhe portões ao redor do eixo indicando tamanho e intensidade de fluorescência. Os valores para canais fluorescentes devem ser determinados empiricamente. Em seguida, coloque uma placa de vários poços ou placa de Petri embaixo do dispensador para coletar as minhocas.

Em seguida, abra a válvula de classificação para começar a classificar as minhocas. Colete uma pequena população de animais para verificar ao microscópio se a população classificada é a população de interesse. Caso contrário, ajuste os parâmetros de gating de acordo e continue com a coleta de amostras.

Quando a idade correspondeu à elegância do mar geneticamente idêntica que são expostos à GFP expressando posa resulta em uma ampla distribuição nos níveis de colonização, a separação eficiente de vermes não colonizados de colonizados foi alcançada usando um classificador de minhocas. Ao contrário dos vermes não colonizados, os vermes colonizados mostram sinais evidentes de lentidão e reduzem a defecação. Este último pode ser uma razão pela qual os vermes colonizados por P arosa têm dificuldade em eliminar a infecção.

Quatro genes foram induzidos de forma semelhante à exposição a P arosa, independentemente do status de colonização dos vermes, e o R-T-P-C-R quantitativo foi usado para medir a expressão dos genes. Os quatro genes são conhecidos por fazerem parte da resposta imune do CL egan. Lys dois codifica uma lisozima, dois genes não caracterizados, resposta especificamente à infecção, dos quais um também contribui para a resistência à infecção, e PGP cinco responde à infecção, bem como ao estresse por metais pesados.

Os resultados corroboram os resultados publicados anteriormente, indicando que a colonização e seus danos associados não são necessários para uma resposta imune. Em vez disso, apontando para padrões moleculares associados a patógenos como os dados de sinal mostrando que o PGP cinco é induzido em animais não colonizados, que não devem estar experimentando. Danos extensos sugerem uma sobreposição nos programas regulatórios, controlando as respostas imunes e as respostas gerais ao estresse na elegância do mar.

Este método pode fornecer novos insights sobre o início das respostas imunes na elegância do mar, mas também pode ser aplicado a outras questões, como os efeitos das condições ambientais ou manipulação genética na colonização ou competição entre diferentes patógenos além dos processos de infecção. Este método também pode ser aplicado para acompanhar outras interações de vermes com seu ambiente, como ingestão ou sequestro de metabólitos ou produtos químicos. Seguindo este procedimento, as populações classificadas de interesse podem ser usadas para uma variedade de propósitos além da expressão gênica.

Isso inclui a coleta de animais vivos para testes subsequentes de infecção ou sobrevivência ou experimentos comportamentais. Esta técnica fornece um meio útil para estudar os efeitos da exposição e colonização de patógenos na imunidade inata e na elegância do mar.