Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

O objetivo geral deste procedimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos com o vírus Sendai. Isso é feito primeiro preparando e plaqueando as células de fibroblastos a serem transduzidas. O próximo passo do procedimento é infectar as células com o vírus Sendai.

Em seguida, as células de fibroblastos infectadas são transferidas para células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongos frescos. A etapa final é escolher manualmente o reprogramado. Agora, as células-tronco pluripotentes, em última análise, a reprogramação de células de fibroblastos em I PSCs, sem o uso de genes trans, pode ser mostrada por meio de imunomarcação e RTPCR.

A principal vantagem desta técnica sobre o método existente é que ela aumenta a eficiência da reprogramação sem permanecer transing e de maneira econômica Para este protocolo, tenha fibroblastos humanos prontos cultivados em DMEM. Com o FBS, transfira essas células para placas de 24 poços para o experimento, coloque as células em seis diluições seriais para determinar a melhor densidade para a fixação celular. Cada fileira da placa de 24 poços pode acomodar uma série de células de diluição.

Assim, quatro tipos de células podem ser testados em uma placa, incubar a diluição por 24 horas. No dia seguinte, selecione poços em três níveis de confluência para transdução. Um em um nível alto de 80 a 90% de confluência, um em cerca de 60% de confluência e o terceiro em cerca de 30% de confluência uma hora ou mais antes da transdução.

Substitua o meio por 300 microlitros de meio de fibroblastos fresco para o descongelamento da transdução. Um conjunto de tubos de vírus Sendai a 37 graus Celsius por alguns segundos e depois termina. Descongelando-os em temperatura ambiente.

Centrifugue os vírus descongelados a 6.000 G por 10 segundos e armazene-os no gelo em um tubo de microcentrífuga. Faça uma mistura dos vírus calculada de acordo com o número de células a serem transduzidas. Os detalhes do cálculo podem ser encontrados no protocolo de texto.

Misture bem os vírus com pipetagem suave. Agora, às células mais densas, adicione dois volumes de vírus. Adicione um volume de vírus às células de densidade média e adicione meio volume de vírus à seleção menos densa.

Gire a placa e deixe-a incubar durante a noite para que a reação ocorra no dia seguinte. Substitua o meio por 500 microlitros de meio de fibroblastos fresco. Faça isso novamente dois dias depois, três dias após a segunda alteração de mídia feita nas células transduzidas.

Prepare células de metanfetamina em placas de 60 milímetros com DMEM contendo 10% de placa FBS 500.000 células por placa e incube-as durante a noite. No dia seguinte, substitua a mídia nas células de metanfetamina por mídia nova e, em seguida, prossiga com a configuração da co-cultura. Primeiro, remova a mídia dos fibroblastos transduzidos e lave-os uma vez com a PPBD.

Em seguida, adicione 200 microlitros de 0,25% de tripsina EDTA a cada poço transduzido de células em cinco minutos. Agrupe todas as células de desprendimento em um único tubo cônico de 15 mililitros. Gire as células a 1.350 G por quatro minutos.

Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células peletizadas com cerca de cinco mililitros de meio fresco para neutralizar o trippino. Agora colete as células com outro giro de quatro minutos a 1.350 G.Próxima placa. A maioria das células tem seis diluições seriais em metanfetamina.

A primeira e a última diluições podem não ser necessárias, dependendo da taxa de mortalidade das células. Guarde algumas das células para uma extração de RNA e incube as placas durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio por meio ES humano suplementado com 10 micromolares de inibidor de RO quinase Y 2 7 6 3 2.

Para melhorar a sobrevivência celular durante os dias seguintes, mude o meio para um meio ES humano normal não suplementado. Após uma semana de cultivo, comece a verificar os pratos a cada poucos dias para a formação de aglomerados de células semelhantes a colônias ES. Assim que aparecerem, monitore o crescimento.

Três semanas após a transdução, as colônias de aglomerados de células ES devem estar prontas para expansão. Preparei células alimentadoras de metanfetamina em placas de 24 poços, assim como foram preparadas para placas de 60 milímetros. Antes de escolher qualquer colônia, troque o meio nas células de metanfetamina por meio ES com 10 microlitros de Y 2 7, 6, 3, 2.

Escolha uma colônia de cada vez nos pratos. Transfira a colônia para um tubo de 15 mililitros com a solução. Quebre a colônia usando o pipetador.

Em seguida, cubra um eu. Bem, com a colônia quebrada. Por fim, carregue cada poço com uma colônia quebrada e carregue o máximo de poços possível.

Mantenha as células com mudanças diárias de mídia e expanda-as para placas de seis poços e, em seguida, placas de 60 milímetros. Normalmente, os fibroblastos infectados pelo vírus Sendai não apresentam alterações morfológicas até depois de cinco dias. Em seguida, as células assumem uma forma redonda com um núcleo maior e um citoplasma menor.

Este protocolo de pequena escala inclui vários parâmetros que podem ser otimizados, como densidade de fibroblastos, título de vírus e densidade de plaqueamento para o mes. A transdução de células em diferentes cofluências mostradas em cores diferentes também pode ser otimizada. Após uma semana de co-cultura com células alimentadoras de metanfetamina, os fibroblastos parcialmente reprogramados têm uma forma solta e são facilmente colhidos em vez de serem coletados usando tripsina.

Totalmente reprogramadas, as I PSCs são claramente identificáveis a partir de células parcialmente reprogramadas. As células totalmente reprogramadas são compactadas e as colônias podem ter limites claros. Células parcialmente reprogramadas formam aglomerados soltos que são facilmente desconectados.

Depois de expandir os clones IPSC por várias semanas, a coloração para marcadores de células-tronco é necessária em comparação com as células H nove. Os IPCs são positivos para vários anticorpos esperados, incluindo SSEA quatro, OCT quatro, TRA 81 e nano G, apoiando sua qualidade pluripotente. O uso da expressão do transgene R-T-P-C-R não foi observado em clones de IPSC humanos.

Após 10 primers para OCT exógena quatro, SOX dois, klf quatro e Cmic foram usados com amostras de controle positivo que apresentaram fortes níveis de expressão transgênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reprogramar células somáticas para induzir as células-tronco polipotentes e como selecioná-las, reprogramar completamente as células das outras células.