Synthèse de ciblage de Monocyte Peptide Amphiphile Micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose

L’objectif global de ce protocole est de synthétiser des micelles amphiphiles peptidiques ciblant les monocytes pour l’imagerie de l’athérosclérose. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine cardiovasculaire sur l’imagerie diagnostique de la plaque d’athérosclérose. Le principal avantage de cette technique est que l’incorporation de micelles peptidiques amphiphiles avec MCP-1 permet une plus grande spécificité de ciblage et une différenciation entre les lésions athéroscléreuses à un stade précoce et avancé.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de la plaque à différents stades de l’athérosclérose, car les patients atteints de plaques tardives sujettes aux ruptures contiennent un nombre plus élevé de monocytes. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’athérosclérose, elle peut également être appliquée à d’autres maladies, telles que le cancer. Jonathan Wang, un étudiant diplômé de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec moi.

Commencez par peser 0,25 millimole de résine fmach-L-lysine-bach-wong dans un récipient de réaction. Transférez le récipient dans une hotte chimique et rincez les côtés du récipient avec cinq millilitres de diméthylforamide. Chargez le récipient de réaction et les flacons d’acides aminés préemballés de l’extrémité C-à-N sur un synthétiseur peptidique de paillasse automatisé, y compris un flacon vide à la fin pour le réglage final de la déprotection.

Après avoir exécuté la synthèse, transférez les peptides et la résine du récipient de réaction dans un flacon à scintillation contenant deux à trois millilitres de méthanol jusqu’à ce que toute la résine ait été transférée. Lorsque la résine a coulé au fond du flacon, retirez le supernane et laissez la résine sécher à l’air, puis faites sécher sous vide pendant au moins deux heures à température ambiante. Lorsque le flacon est complètement sec, à l’aide d’une pince, fixez la moitié inférieure d’un récipient de synthèse sur un agitateur de bras et ajoutez deux millilitres de solution de clivage dans le flacon à scintillation.

Transférez tout le volume de résine peptidique dans le récipient de synthèse et lavez les côtés du récipient avec trois millimètres de solution de clivage fraîche. Ensuite, secouez le récipient, bouché, pendant quatre heures à 300 oscillations par minute. À la fin de l’incubation par agitation, égouttez la solution peptidique clivée dans un tube conique équilibré de 50 millilitres et rincez le récipient de synthèse plusieurs fois avec le reste de la solution de clivage.

Évaporez la solution peptidique clivée avec de l’azote jusqu’à ce qu’il reste moins de quatre millilitres de solution dans le tube à centrifuger et ajoutez 36 millilitres d’éther glacé à la solution clivée peptidique. Vortex la solution résultante. Lorsque la suspension devient complètement blanche ou jaune, granulez les peptides par centrifugation.

Remettez le peptide en suspension dans 40 millilitres d’éther glacé et de vortex et sonicez à nouveau le peptide. Après une deuxième centrifugation et une décantation du surnageant, sécher la pastille amphiphile de peptide brut avec une purge à l’azote gazeux. Lorsque l’éther s’est visiblement évaporé, ajoutez 20 millilitres d’eau double distillée dans le tube et faites un vortex et sionisez le tube jusqu’à ce que le peptide soit complètement dissous en solution.

Congelez la solution et lifelize jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Ensuite, pesez à nouveau le tube et dissolvez le peptide brut dans cinq milligrammes par millilitre d’eau. Ensuite, injectez tout le volume de peptide MCP-1 brut dans un instrument de chromotographie liquide ou HPLC haute performance.

Analysez chaque fraction à l’aide de la spectroscopie de masse par désorption ionisation laser assistée par matrice pour la charge massique attendue du produit à 2 890. Combinez ensuite les fractions de produit. Soufflez l’acétonitrile et congelez et lifelisez les peptides purifiés jusqu’à ce qu’ils soient secs.

Pour préparer le peptide amphiphile MCP-1 ou PA, dissolvez d’abord le peptide lifelized dans 15 milligrammes par millilitre d’eau et combinez la solution peptidique avec 15 milligrammes par millilitre de solution millimétrique DSPE PEG 2000. Ajoutez une mole d’hydroxyde de sodium goutte à goutte jusqu’à ce que le pH de la solution soit égal à sept. Ensuite, purgez l’azote pendant cinq minutes, puis remuez pendant la nuit.

Le lendemain matin, congelez et lifelisez la solution. Lorsque le produit brut est sec, dissolvez le solide dans cinq milligrammes par millilitre d’eau et purifiez le peptide par HPLC, comme nous venons de le démontrer. Pour assembler les membranes PA, dissolvez 1,75 milligramme de PA MCP-1 dans trois millilitres de méthanol dans un flacon d’un dram et sonicate jusqu’à ce que le PA MCP-1 soit complètement dissous.

Évaporez le méthanol sous l’azote tout en déplaçant le flacon d’un mouvement circulaire et en rinçant le méthanol restant sur les côtés du flacon, jusqu’à ce qu’un film uniforme se forme au fond. Faites sécher le film sous vide pendant la nuit. Le lendemain matin, hydratez le film avec trois millilitres d’eau pour obtenir une solution de MCP-1 PAM de 100 micromolaires et agitez doucement la solution jusqu’à ce qu’elle soit claire.

Incuber la solution à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis refroidir la dispersion obtenue. Dans l’expérience représentative suivante, le MCP-1 et le peptide brouillé ont été purifiés par HPLC en phase inverse sur une colonne d’AC à 50 degrés Celsius en utilisant 0,1 % d’acide trifluoroacétique dans des mélanges d’eau acétonitrile. Et caractérisé par une spectrométrie de masse par ionisation par désorption laser assistée par matrice, comme cela vient d’être démontré.

Les peptides contenant le désistement ont été conjugués sur du milliamide DSPE PEG 2000 pour produire des conjugués peptidiques DSPE PEG 2000 via une liaison thioéther et purifiés par HPLC à l’aide d’une colonne C4. L’analyse de la diffusion dynamique de la lumière et l’imagerie par microscopie électronique à transmission des monocytes ciblant les PAM ont révélé des nanoparticules sphériques bien dispersées avec des potentiels zêta légèrement positifs. L’analyse par spectroscopie circulaire a confirmé que l’incorporation du peptide MCP-1 dans la micelle a amélioré la structure secondaire.

Les monocytes d’incubation amalse avec des concentrations micromolaires allant jusqu’à 100 micromolaires de peptide MCP-1, de PAM MCP-1, de peptide brouillé et de PAM brouillé pendant 72 heures ont démontré la viabilité et la biocompatibilité des peptides. La liaison spécifique des monocytes aux PAM MCP-1 par rapport aux PAM brouillés est ensuite établie par microscopie confocale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer un monocyte ciblant le peptide amphiphile, micelle, grâce à la synthèse et à la purification du peptide MCP-1, à l’assemblage de l’amphiphile et des micelles du peptide MCP-1.

N’oubliez pas que travailler avec un réactif chimique peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que la lecture de la fiche signalétique et le travail à l’intérieur d’une hotte chimique, doivent toujours être prises lorsque vous travaillez avec ces matériaux.