Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

Este protocolo es útil para el aislamiento enteroide en un cultivo, además de investigar la proliferación celular y la supervivencia en enteroides. Los científicos pueden aplicar esta técnica a los enteroides de cultivo y para estudiar el efecto de los medicamentos y las citoquinas inflamatorias en las células epiteliales intestinales in vitro. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de agua de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Aplicamos este método para encontrar algunas citoquinas terapéuticas. Este método proporciona información sobre la proliferación epitelial intestinal y la supervivencia;además también se puede utilizar en organoides, cultivados alrededor de tejidos distintos del intestino. Para aislar criptas intestinales y realizar cultivos enteroides, utilice fórceps tisulares y encuentre tijeras de iris para diseccionar aproximadamente ocho centímetros de íleon de un ratón de tipo salvaje eutanizado de ocho semanas de edad.

Utilice una jeringa con una aguja de alimentación de gavage para lavar el íleon con unos 40 mililitros de hielo frío Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, luego corte longitudinalmente con tijeras y abra el íleon. Corte el íleon en trozos pequeños y colóquelos en cinco mililitros de DPBS estériles helados en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego mece la muestra durante cinco minutos sobre hielo.

Utilice un controlador de pipeta para aspirar el DPBS y reemplazarlo con 10 mililitros de tampón frío uno. Después de balancear durante 30 minutos sobre hielo, utilice el controlador de pipeta para aspirar el buffer uno y reemplazarlo con 10 mililitros de tampón frío dos. A continuación, agitar durante dos o tres minutos a mano a aproximadamente 80 batidos por minuto.

Después de agitar, inspeccione una gota de veinte micro litros de buffer dos contenidos bajo un microscopio para asegurarse de que hay criptas con células Paneth granulares. Filtre el búfer dos contenidos con un colador celular estéril de 70 micras y recoja el búfer filtrado en un tubo cónico de 50 mililitros. Pipetear 20 microlitros de filtrado en la diapositiva para contar las criptas.

Transfiera un volumen suficiente del búfer filtrado dos contenidos para asegurarse de que hay aproximadamente 500 criptas por pozo. Gire a 150 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y luego aspire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las criptas en 50 microlitros de matriz de membrana sótano por 500 criptas.

Pipetear hacia arriba y hacia abajo teniendo cuidado de evitar burbujas. Coloque una gota de 50 microlitros de matriz de membrana de sótano y mezcla de cripta en el centro de un pozo de una placa de 24 pozos. Incubar durante 30 minutos a 37 grados Celsius para polimerizar la matriz de membrana del sótano.

Después de 30 minutos de polimerización, agregue cuidadosamente 600 microlitros de medios minigut a cada pozo. Devuelva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius, y observe bajo un microscopio cada día, cambiando los medios cada dos o tres días. Para pasar los enteroides, coloque la placa de cultivo de tejido sobre hielo, aspire los medios y agregue un mililitro de DPBS frío a cada pozo.

Utilice una punta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos de matriz. Pase la muestra a través de una jeringa de insulina de un mililitro y hacia abajo en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de girar hacia abajo durante cinco minutos a 150 veces G y cuatro grados Celsius, utilice una pipeta para quitar el DPBS.

Vuelva a suspender los enteroides en 50 microlitros de matriz de membrana sótano por pozo. Coloque la placa en la incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir que la matriz de membrana del sótano se polimerice. A continuación, superponga cada pozo con 600 microlitros de medios ENR y devuelva la placa a la incubadora.

Cultivar enteroides durante cinco a siete días antes de pasarlos en una nueva placa de 24 pozos usando una relación de división de uno a dos. Añadir 600 microlitros de medio ENR a cada pozo, y luego incubar los enteroides durante cuatro a cinco días en la incubadora de 37 grados Celsius. Configurar el grupo de control de enteroides no tratados y el grupo experimental de enteroides tratados con cinco nanogramos por mililitro de interleucina-22.

Prepare al menos tres réplicas para cada grupo. Añadir 600 microlitros de medio EdU a cada pozo de enteroides, excepto uno bien para usar como control negativo para la resta de fondo. Incubar la placa durante dos horas en una incubadora de 37 grados centígrados.

Para cosechar enteroides de la matriz de membrana del sótano, utilice un controlador de pipeta para aspirar el medio EdU y lavar una vez con DPBS. A continuación, agregue un mililitro de DPBS. Utilice una punta de pipeta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano.

Transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros y gire hacia abajo a 300 veces G durante cinco minutos antes de desechar el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de enzimas de disociación celular e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, utilice una punta de pipeta P200 para pipetear hacia arriba y hacia abajo y descomponer enteroides en células individuales.

A continuación, añada tres mililitros del medio de águila modificada de Dulbecco que contenga un suero bovino 10% fetal, y pipetear repetidamente con una punta de pipeta P1000. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, y aspirar el sobrenadante, suspendemos las células en un mililitro de DPBS. Para realizar la fijación y permeabilización de las células, primero transfiera la suspensión celular a un tubo de un punto y cinco mililitros, gire hacia abajo a 300 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.

Suspendemos las células en un mililitro de 4%paraformaldehído y arreglamos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante con una punta de pipeta. Lave las células una vez con el DPBS, y gire hacia abajo de nuevo para quitar el sobrenadante.

Resuspender las células con un mililitro de 0.5%surfactante no iónico, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de lavar las células con DPBS como antes. Para detectar el EdU, añada 100 microlitros de cóctel de reacción a cada tubo de 1,5 mililitros. Resuspender las células, y protegerlas de la luz, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, aspirar suavemente la solución de reacción con una punta de pipeta Añadir 0.5% tensioactivo no iónico penetrante a cada tubo para lavar una vez a temperatura ambiente. Después de la centrifugación como antes, suspendemos las células en un mililitro de DPBS. Filtrar las células resuspendidas con un colador de 40 micras y recoger las células filtradas en un tubo cónico de 15 mililitros.

Realice los hechos sobre la detección de la máquina tan pronto como sea posible. Seleccione el canal y la tensión adecuados para el análisis de citometría de flujo. Para la estrategia de medición, dibuje una gráfica pseudocolor FSC-A frente a SSC-A y distribuya la mayoría de las celdas al rango visible del mapa de puntos ajustando el voltaje.

Seleccione la población de celdas como R1 y excluya los restos de celda en la esquina inferior izquierda. A partir de la población celular R1, establezca una gráfica pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Establezca la puerta para seleccionar celdas individuales designadas como R2 y excluir grumos de celda.

Desde la población de células R2, establezca la intensidad de fluorescencia frente a la gráfica de número de celda y utilice el control negativo para establecer la puerta. La región de la señal fluorescente es una región celular positiva designada R3.Compare la relación de estas células positivas EdU entre los grupos experimentales y de control. Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano.

Los enteroides comenzaron a formar brotes dos días después del aislamiento. En el sexto día, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos escombros en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser pasados en esta etapa.

Los enteroides fueron tratados con IL-22 durante 3 días, después de lo cual el ADN sintético fue etiquetado con EdU en rojo para indicar la proliferación celular. Los enteroides tratados IL-22 mostraron un mayor número de células positivas de EdU. IL-22 aumentó las células proliferantes del 40,1% al 83,5% según lo analizado por la citometría de flujo.

El tratamiento con IL-22 también aumentó la muerte celular en enteroides indicados por la tinción de yoduro propidium en rojo. IL-22 aumentó las células muertas del 4,9% al 16,2% según lo analizado por la citometría de flujo. Durante el progreso de aislamiento de la cripta se necesita un temblor justo después de agregar búfer para asegurarse de que se sacuden suficientes criptas.

Aconsejamos inspeccionar el contenido bajo microscopio. Después de este procedimiento, también podemos cuantificar los tipos de epiteliales y enteroides diferenciados mediante el uso específico Este método ayudará a los investigadores a investigar la diferenciación epitelial intestinal en enteroides. Después de su desarrollo, esta pregunta allana un camino para que los investigadores en el campo de la gastroenterología exploren las cuestiones de desarrollo o patológicas en el corte.