Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM
26 juillet 2021
Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à des températures aussi élevées que 70 °C, avant la congélation pour les expériences cryo-EM.
Les fonctions des protéines dépendent de la température et sont optimales à la température. Ce protocole fournit un moyen de résoudre les structures protéiques à des températures plus élevées. Cette approche peut fournir des structures fonctionnellement pertinentes et améliorer la compréhension de la dépendance à la température des structures protéiques.
Yuan-Chih Chang, directeur de l’installation Academia Sinica Cryo EM, fera la démonstration de la procédure. Commencez par faire un trou d’un centimètre dans un tube centrifuge de 50 millimètres à son extrémité fermée. Placez le tube dans la chambre de l’appareil de vitrification à la sortie d’eau à ultrasons.
Réglez la température de l’appareil de vitrification à la température spécifiée et laissez la chambre de l’appareil de vitrification atteindre 55 degrés Celsius et 100% d’humidité relative. Laissez reposer pendant au moins une demi-heure pour stabiliser les conditions avant de commencer l’expérience. Placez le bain-marie sur une plaque chauffante et réglez la plaque chauffante à la température désirée.
Vérifiez avec un thermomètre pour vous assurer que l’eau atteint 55 degrés Celsius. Incuber l’échantillon au bain-marie et préchauffer l’embout de la pipette sur le bord de la plaque chauffante pendant deux minutes ou plus avant l’expérience de buvardage. Décharge luminescente une grille supportée par du carbone troué à 25 milliampères pendant 30 secondes.
Placez le papier filtre de vitrification dans la chambre de l’appareil de vitrification au plus tôt cinq minutes avant l’expérience de buvardage. Incuber la pince à épiler avec la grille dans l’appareil de vitrification pendant deux minutes ou plus. Construisez le récipient d’éthane avec de l’éthane selon les procédures standard, en veillant à ce que l’éthane ne déborde pas.
Utilisez une pipette pour appliquer sept à neuf microlitres de l’échantillon sur la grille. Ensuite, attendez une à deux secondes, épongez pendant une à une seconde et demie et plongez rapidement l’échantillon dans de l’éthane liquide. Transférer la grille de l’éthane liquide à la boîte cryogénique stockée dans de l’azote liquide.
Coupez les grilles et déchargez-les pour acquérir un microscope électronique ou un instrument Cryo EM. Utilisez l’écran d’affichage de l’instrument Cryo EM et la fonction de faible dose du logiciel pour examiner l’état de la glace sur la grille et la distribution de l’échantillon sur la grille. Si la qualité de la grille résultante n’est pas bonne, répétez le processus de préparation de la grille avec des conditions variées telles que le temps d’attente, le temps de buvardage, etc.
Si la qualité de la grille résultante est bonne, répétez les mêmes étapes pour créer des grilles à une température différente. Transférez les grilles de bonne qualité sur un instrument Cryo EM haute résolution. Effectuer la collecte et l’analyse des données selon les procédures établies.
Dans le cas de la grille réussie, un gradient de glace s’est formé avec de la glace plus épaisse en haut à gauche de la grille et de la glace plus mince en bas à droite. Des cases bleues et vertes convenant à la collecte de données ont été observées dans la grille de réussite. Un contraste lumineux a été observé dans l’autre grille.
Indiquant une fine couche de glace ou une absence de glace. Seuls deux carrés se sont révélés appropriés pour la collecte de données dans la deuxième grille. L’une des grilles était constituée de glace principalement sous forme cristalline, ce qui ne convenait pas à la collecte de données.
D’autre part, l’autre grille a montré que la couche de glace était principalement dans un état amorphe adapté à la collecte de données. La préparation du conteneur et d’autres doivent être terminées en fonction d’un point de temps. Le contrôle du temps et la finition rapide et précise de l’expérience sont les plus importants.
Selon les résultats obtenus à l’aide de ce protocole, le chercheur devra peut-être être plus prudent dans la mise en place des conditions simples.
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Aperçu
Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d'échantillons à des températures allant jusqu'à 70 °C, avant la congélation par immersion pour des expériences de microscopie électronique cryogénique. Cette approche améliore la compréhension de la dépendance à la température des structures protéiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microscopie électronique cryogénique (cryo-EM)
- Analyse de la structure des protéines
- Effets de la température sur les protéines
Contexte
- Les fonctions des protéines dépendent de la température.
- Les températures optimales peuvent varier selon les protéines.
- La compréhension des structures protéiques à des températures élevées est cruciale.
- Ce protocole vise à fournir des structures fonctionnellement pertinentes.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour la préparation de grilles d'échantillons à des températures élevées.
- Approfondir la compréhension de la structure et de la fonction des protéines.
- Montrer la procédure pour des expériences de microscopie électronique cryogénique (cryo-EM).
Méthodes utilisées
- Créer un trou dans un tube de centrifugation.
- Utiliser un appareil de vitrification.
- Plonger des échantillons dans l'azote liquide pour la cryo-microscopie électronique.
- Démonstration par Yuan-Chih Chang.
Résultats principaux
- Préparation réussie de grilles d'échantillons à haute température.
- Compréhension améliorée des structures protéiques dépendantes de la température.
- Procédure démontrée pour une analyse efficace par cryo-microscopie électronique.
- Potentiel de pertinence fonctionnelle en biologie structurale.
Conclusions
- Le protocole permet l'étude des protéines à des températures plus élevées.
- Il fournit des informations sur la dépendance à la température des structures protéiques.
- Cette méthode peut être bénéfique pour de futures expériences de cryo-ME.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préparation de grilles d'échantillons à haute température pour la microscopie électronique cryogénique permet l'analyse structurale de protéines dans des conditions thermiques physiologiquement pertinentes, comblant ainsi une lacune critique pour les cibles thermophiles. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive de la validation des cibles en garantissant que les conformations observées reflètent des états fonctionnels. L'intégration d'une préparation de grilles cryo-EM contrôlée en température soutient l'avancement ajusté au risque d'actifs structuralement complexes ou sensibles à la température dans les phases précoces des voies de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse structurale des protéines à des températures correspondant à leurs environnements natifs ou fonctionnels.
- Améliore la détection des risques biologiques en révélant les états conformationnels dépendants de la température.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles pour les protéines thermophiles et sensibles à la température.
- Facilite le tri du portefeuille en distinguant les artéfacts des structures pertinentes sur le plan physiologique.
Développement de tests et criblage
- Prépare des grilles de cryo-ME validées pour des flux de travail d'imagerie à haute résolution en aval.
- Normalise l'évaluation de la qualité des grilles grâce à un contrôle reproductible de la température et de l'humidité.
- Permet une évaluation quantitative de l'épaisseur de la glace et de la distribution de l'échantillon en vue du criblage.
- Facilite une évaluation fiable des composés en garantissant la pertinence structurale des cibles d'essai.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les données structurales avec les conditions de température pertinentes pour la maladie ou spécifiques à l'organisme.
- Améliore la continuité translationnelle en réduisant les divergences entre les états protéiques in vitro et in vivo.
- Réduit les risques lors du passage à l'avancement préclinique en confirmant la pertinence fonctionnelle des résultats structuraux.
- Facilite l'alignement des biomarqueurs lorsque les conformations dépendantes de la température sont mécaniquement liées à la maladie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole étend le flux de travail de cryo-microscopie électronique depuis la préparation standard à basse température jusqu'aux conditions de haute température, comblant ainsi le fossé entre la découverte précoce et la recherche préclinique pour les cibles sensibles à la chaleur.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur la fonction et la structure des protéines dépendantes de la température.
- Écrantage : Fournit des métriques quantitatives reproductibles de la qualité des grilles pour l'imagerie et l'analyse ultérieures.
- Analytique : Permet une comparaison directe des états structuraux dans différentes conditions de température à l'aide de lectures par cryo-microscopie électronique.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des données structurales avec des environnements physiologiques ou liés à des maladies.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole réutilisable pour la préparation de grilles à haute température sur diverses cibles protéiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en capturant des conformations fonctionnellement pertinentes.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des grilles à haute température pour assurer la reproductibilité et l'extensibilité.
- Valeur stratégique : Permet de prendre de meilleures décisions « aller/ne pas aller » en réduisant l'ambiguïté mécanistique des données structurales.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des actifs présentant des caractéristiques structurales dépendantes de la température.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la préparation des grilles de cryo-ME et la manipulation d'échantillons sous contrôle thermique.
- Exige un appareil de vitrification spécialisé, capable d'une régulation précise de la température et de l'humidité.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles d'évaluation de la qualité des grilles et de collecte des données.
- Peut nécessiter des adaptations selon les classes de protéines ou les plages de température spécifiques aux organismes.
- Un contrôle rigoureux du temps et une exécution rapide sont essentiels pour minimiser les artefacts de glace et assurer la reproductibilité.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Preparation of the Vitrification Apparatus
1:23
Warming Up the Sample and the Tools
1:49
Blotting Experiment
2:47
Quality Check for the Grids and Data Collection
3:40
Results: High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM
4:25
Conclusion
