Das Genom der Influenza A-Virus besteht aus acht separaten Komplexen von RNA und Proteinen, genannt virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs). Dieses Papier beschreibt die Glycerin Gradientenreinigung und Transmissionselektronenmikroskopie Visualisierung von Influenza-A-vRNPs.
Abstract
Das Influenza-A-Virus-Genom besteht aus acht negativen Sinne, einsträngige RNA-Moleküle, die individuell mit mehreren Kopien des Influenza-A-Nukleoprotein (NP) in virale ribonulceoprotein Partikel (vRNPs) verpackt. Die Influenza vRNPs sind innerhalb der Virushülle umgeben. Während Eindringen in die Zelle, jedoch sind diese vRNP Komplexe in das Zytoplasma freigesetzt, wo sie Zugriff auf den Host Kerntransport Maschinen zu gewinnen. Um die nukleare Import von Influenza vRNPs und die Replikation des Influenza-Genom-Studie, ist es sinnvoll, mit isolierten vRNPs Arbeit, so dass andere Komponenten des Virus nicht mit diesen Prozessen stören. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um diese vRNPs von der Influenza A-Virus zu reinigen. Das Verfahren beginnt mit der Unterbrechung der Influenza-A-Virion mit Reinigungsmitteln, um die vRNP Komplexe aus den umhüllten Virion freizugeben. Die vRNPs werden dann von den anderen Komponenten des Influenza-A-Virion auf einem 33-70% diskontinuierliche Glycerin-Gradienten durch Geschwindigkeit Sedimentation abgeschieden. Die Fraktionen aus der Glycerin-Gradienten gewonnen werden dann über SDS-PAGE nach Färbung mit Coomassie-Blau analysiert. Die Peak-Fraktionen, die NP werden dann gepoolt und konzentriert durch Zentrifugation. Nach Einengen wird die Integrität der vRNPs durch Visualisierung der vRNPs durch Transmissionselektronenmikroskopie nach negativen Färbung überprüft. Das Glycerin Gradientenreinigung ist eine Abwandlung davon aus Kemler<em> Et al.</em> (1994)<sup> 1</sup>, Und die negative Färbung wurde von Wu durchgeführt<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Teil 1: Störung des Influenza-A-Virion Add 750 ul der MNT-Puffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in einem Beckman Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (11 mm x 34 mm) entwickelt, um in eine TLA-120,2 Rotor für den Einsatz in einem Beckman Optima fit Max-E Ultrazentrifuge. Add 500 ul des Influenza A Virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 Stamm; 2 mg / ml) in die Röhre. Mix das Virus mit der MNT-Puffer durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. Zentrifuge für 10 Minuten bei 109.000 xg, 4 ° C …
Discussion
Die Reinigung von vRNPs wird über das Verfahren durch Kemler et al. (1994) beschrieben wird. 1 Wir und andere haben auch dieses Protokoll verwendet, um vRNPs zu isolieren, um ihre nuklearen Import-Studie. 2,4,5
Wir empfehlen die Verwendung von RNase-freien Spitzen und Rohre beim Manipulieren vRNPs weil das virale Genom von RNA besteht, und damit verschlechtert sich leicht in die Gegenwart von RNA. Darüber hinaus sollten alle Puffer in Wasser, RNase frei gemac…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canada Foundation for Innovation (CFI), die Canadian Institute of Health Research (CIHR) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt.
Wu, W. W., Weaver, L. L., Panté, N. Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes. J. Vis. Exp. (24), e1105, doi:10.3791/1105 (2009).