Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Summary

Il genoma del virus influenzale A si compone di otto complessi separati di RNA e proteine, chiamate complessi ribonucleoproteina virale (vRNPs). Questo documento descrive la purificazione gradiente glicerolo e microscopia elettronica visualizzazione trasmissione di influenza A vRNPs.

Abstract

L'influenza A genoma virale è costituito da otto-senso negativo, singole molecole di RNA, confezionati singolarmente con più copie del influenza A nucleoproteina (NP) in particelle ribonulceoprotein virale (vRNPs). Il vRNPs dell'influenza sono racchiusi all'interno della busta virale. Durante l'immissione delle cellule, tuttavia, questi complessi vRNP vengono rilasciati nel citoplasma, dove l'accesso al macchinario di trasporto nucleare host. Per studiare l'importazione nucleare di vRNPs influenza e la replicazione del genoma dell'influenza, è utile per lavorare con vRNPs isolato in modo che gli altri componenti del virus non interferiscono con questi processi. Qui, descriviamo una procedura per purificare queste vRNPs dal virus. La procedura inizia con la rottura del virione influenza A con detergenti al fine di rilasciare i complessi vRNP dal virione avvolto. Il vRNPs vengono separati dagli altri componenti del virione influenza A su una pendenza 33-70% glicerolo discontinuo per sedimentazione velocità. Le frazioni ottenuto dal gradiente di glicerolo vengono poi analizzati attraverso SDS-PAGE dopo colorazione con Coomassie blu. Le frazioni di punta contenenti NP sono poi sommati insieme e concentrato per centrifugazione. Dopo la concentrazione, l'integrità del vRNPs è verificata da visualizzazione del vRNPs tramite microscopia elettronica a trasmissione dopo colorazione negativa. La purificazione gradiente di glicerolo è una modifica di quella di Kemler<em> Et al.</em> (1994)¹, E la colorazione negativa è stata eseguita da Wu<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup

Protocol

Parte 1: L'interruzione della Influenza A Virion Aggiungere 750 ml di tampone MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in una centrifuga Beckman tubo di policarbonato (11 mm x 34 mm) progettato per adattarsi in un TLA-120,2 rotore per l'uso in Optima Beckman Max-E ultracentrifuga. Aggiungere 500 ml di virus influenzale A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 ceppo; 2 mg / ml) in quel tubo. Mescolare il virus con il tampone MNT pipettando su e giù parecchie volte. Centrifugare per 10 minut…

Discussion

La purificazione di vRNPs si basa sulla procedura descritta da Kemler et al. (1994) ^1. Noi e gli altri hanno usato anche questo protocollo per isolare vRNPs di studiare la loro importazione nucleare. ^2,4,5

Si consiglia l'uso di RNasi-free suggerimenti e tubi durante la manipolazione vRNPs perché il genoma virale è costituito da RNA, e quindi facilmente degrada in presenza di RNA. Inoltre, tutti i buffer dovrebbe essere effettuato in acqua che è RNasi lib…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A		Charles River Laboratories	490715
Tris		Sigma	T1503
MES		Sigma	M-8250
Glycerol		Fisher	G33-1
Octylglucoside		Sigma	O-8001
Lysolecithin		Sigma	L-4129
Dithiothreitol		Sigma	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250		Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water		Invitrogen	750024
Uranyl Acetate		Ted Pella	19481
Ammonium Molybdate		Fisher	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge		Beckman Coulter	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket		Beckman Coulter	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium		Beckman Coulter	362046
Eppendorf Thermomixer		Brinkman	022670000