Hier beschrijven we een basisprotocol voor TL-etikettering van de verschillende elementen van het hart buizen van larven en volwassen<em> Drosophila melanogaster</em>. Deze exemplaren zijn zeer geschikt voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Deze techniek maakt gedetailleerde structurele analyse van de kenmerken van de harten van een krachtig model organisme.
De<em> Drosophila melanogaster</em> Dorsale vat, of hart, is een buisvormige structuur bestaat uit een enkele laag van contractiele cardiomyocyten, pericardiale cellen die lijn langs elke kant van de hartwand, ondersteunende Alary spieren en, bij volwassenen, een laag van ventrale longitudinale spiercellen. De contractiele vezels huis bewaarde onderdelen van de spier cytoarchitecture ook dicht op elkaar gepakte bundels van myofibrillen en het cytoskelet / submembranous eiwitcomplexen, die interageren met homologe componenten van de extracellulaire matrix. Hier beschrijven we een protocol voor de fixatie en de fluorescerende etikettering van bepaalde myocard elementen uit de harten van ontleed larven en semi-intacte volwassen<em> Drosophila</em>. In het bijzonder tonen we de etikettering van sarcomeer F-actine en van α-actinine in larvale harten. Daarnaast voeren we de etikettering van F-actine en α-actinine in myosine-GFP expressie volwassen vliegen en van α-actinine en pericardin, een type IV extracellulaire matrix van collageen, in het wild type volwassen harten. Bijzondere aandacht wordt gegeven aan een montage van de strategie voor de semi-intacte volwassen harten dat de behandeling minimaliseert en optimaliseert de mogelijkheden voor het behoud van de integriteit van de hart-buizen en de omliggende weefsels. Deze preparaten zijn geschikt voor de beeldvorming via fluorescentie en confocale microscopie. Het geheel genomen, deze procedure zorgt voor een zorgvuldige en gedetailleerde analyse van de structurele kenmerken van het hart van een krachtige genetisch soepel model systeem.
Hier presenteren wij een protocol nuttig voor het opstellen en kleuren van de Drosophila melanogaster dorsale vat en de omliggende weefsels voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Wij bieden een beknopt verslag van de stappen verfijnd door en algemeen gebruikt in ons lab voor effectieve kleuren die goed opgelost vergunningen in situ beeldvorming van larven en volwassen Drosophila hart buizen. Anderen hebben soortgelijke methoden beschreven in verkorte vorm 2, 3, 4. …
De auteurs danken SI Bernstein (San Diego State University) voor het kritisch lezen en nuttige suggesties met betrekking tot de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen aan SI Bernstein, SDSU, en R. Bodmer, BIMR en door een post-doctorale beurs uit de Westerse staten Partner van de American Heart Association aan G. Vogler en A. Cammarato.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |