Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón
Summary
Aquí se describe un protocolo básico para el marcaje fluorescente de diferentes elementos de los tubos de corazón de la larva y el adulto<em> Drosophila melanogaster</em>. Estas muestras son adecuadas para las imágenes a través de microscopía de fluorescencia confocal o. Esta técnica permite el análisis estructural detallado de las características de los corazones de un organismo modelo de gran alcance.
Abstract
La<em> Drosophila melanogaster</em> Vaso dorsal, o el corazón, es una estructura tubular que consta de una sola capa de cardiomiocitos contráctiles, células pericárdicas que se alinean a lo largo de cada lado de la pared del corazón, los músculos de apoyo Alary y, en adultos, una capa de células de músculo longitudinal ventral. La casa de las fibras contráctiles conservan los componentes de la citoarquitectura músculos incluidos los paquetes compactos de las miofibrillas y complejos de proteínas del citoesqueleto / submembranous, que interactúan con homólogos de los componentes de la matriz extracelular. Aquí se describe un protocolo para la fijación y el marcaje fluorescente de elementos particulares de miocardio del corazón de las larvas y adultos disecados semi-intacta<em> Drosophila</em>. En concreto, se demuestra el etiquetado de los sarcoméricas F-actina y α-actinina en el corazón de las larvas. Además, llevamos a cabo el etiquetado de los F-actina y α-actinina en la miosina-GFP expresando las moscas adultas y de la α-actinina y pericardin, un colágeno tipo IV de la matriz extracelular, en el medio silvestre corazones de tipo adulto. Se presta especial atención a una estrategia de fijación de los corazones de adultos semi-intacta que minimiza el manejo y optimiza la oportunidad de mantener la integridad de los tubos cardíacos y los tejidos asociados. Estas preparaciones son adecuadas para las imágenes a través de microscopía de fluorescencia y confocal. En general, este procedimiento permite realizar un análisis cuidadoso y detallado de las características estructurales del corazón de un potente sistema genético modelo manejable.
Protocol
Discussion
Aquí se presenta un protocolo útil para la preparación y la tinción de la embarcación Drosophila melanogaster dorsal y los tejidos a través de imágenes de microscopía de fluorescencia confocal o. Ofrecemos un relato conciso de los pasos y refinado por empleado comúnmente en nuestro laboratorio para la tinción de efectivo que permita bien resueltos en las imágenes in situ de las larvas y adultos tubos corazón Drosophila. Otros han descrito métodos similares en forma abrevi…
Acknowledgements
Los autores agradecen SI Bernstein (San Diego State University) para la lectura crítica y sugerencias relativas a la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH para SI Bernstein, SDSU, y R. Bodmer, BIMR, y por una beca post-doctoral de la Filial Oeste de los Estados de la Asociación Americana del Corazón para G. Vogler y A. Cammarato.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
Riferimenti
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