Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang Et al. Per la rilevazione di media 4 ng proteine in gel. La colorazione è completata entro 2 ore e senza alcuno sforzo. Noi abitualmente utilizzano il protocollo di Kang per scopi di analisi in gel a base di proteomica.
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Articolo metodologico
Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine in gel di poliacrilammide
In questo articolo
Sommario
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine separate mediante SDS-PAGE, offrendo una procedura semplice colorazione e quantificazione alto. Inoltre, è completamente compatibile con l'identificazione delle proteine spettrometria di massa. Ma nonostante questi vantaggi, CBB è considerato essere meno sensibile di colorazioni argento o fluorescenza e quindi raramente utilizzato per la rilevazione di proteine in gel analitici approcci basati sulla proteomica.
Diversi miglioramenti del protocollo originale Coomassie 1 sono stati fatti per aumentare la sensibilità della CBB. Due importanti modifiche sono state introdotte per migliorare la rilevazione di proteine a bassa abbondanza convertendo le molecole di colorante in particelle colloidali: Nel 1988, Neuhoff e colleghi hanno applicato il 20% metanolo e concentrazioni più elevate di solfato di ammonio nel G-250 CBB soluzione colorante a base 2, e nel 2004 Candiano et al. stabilito Blue Silver con CBB G-250 con acido fosforico in presenza di solfato di ammonio e metanolo 3. Tuttavia, tutte queste modifiche solo permettono una rilevazione di circa 10 proteine ng. Un protocollo ampiamente fameless per la colorazione Coomassie colloidale è stato pubblicato da Kang et al. Nel 2002 dove si è modificato Neuhoff colloidale protocollo di colorazione CBB per quanto riguarda le sostanze complessanti. Invece di solfato di ammonio hanno usato solfato di alluminio e il metanolo è stato sostituito dal 4 etanolo meno tossici. Il romanzo a base di alluminio colorazione in studio Kang ha dimostrato una sensibilità superiore che rileva fino a 1 ng / banda (fosforilasi b) con variazione scarsa sensibilità in funzione delle proteine.
In questo studio dimostriamo applicazione del protocollo di Kang per una rapida e sensibile colorazione Coomassie colloidale di proteine per scopi di analisi. Ci illustrerà il protocollo veloce e semplice utilizzando bidimensionali gel eseguita di routine nel nostro gruppo di lavoro.
Protocollo
Parte 1: bidimensionale (2-D), elettroforesi su gel con coppa di carico
- IPG-strip reidratazione e concentrandosi isoelettrico (IEF)
- Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) in 125 microlitri soluzione di reidratazione [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] usa il cassetto Immobiline DryStrip Reswelling per almeno 10 ore.
- Sciogliere campione precipitato proteine in un tampone campione IEF [7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] corrispondente a 60-100 mg di proteine per 100 l .
- Dopo solubilizzazione (almeno 3....
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Discussione
Innovativi o solo un altro protocollo Coomassie?
Al momento esistono diversi protocolli per le procedure di colorazione con Coomassie Brilliant Blue. La maggior parte di loro il risultato di modifiche minori o maggiori di uno dei protocolli più comunemente utilizzati dai Neuhoff e colleghi 2. Anche il protocollo di Kang basato sulla formula di Neuhoff. Ma è davvero un'alternativa metodo di colorazione Coomassie per la ricerca proteomica? Noi immagine due questioni principali, .......
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Dichiarazioni
Non ho nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Nicola Wiethölter per la preparazione e colorazione di 1-D gel.
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e sostenuto da una borsa di ricerca dal Manchot Jürgen Stiftung di ND.
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Materiali
| Nome del prodotto | Azienda | Catalogo No. | Commenti |
| Per IEF e SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gel | GE Healthcare | 17-6001-94 | Può essere utilizzato anche 2 anni dopo la data di scadenza. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Vassoio | GE Healthcare | 80-6371-84 | Non pulire con solventi organici. Progettato per 7-18 centimetri IPG-strisce. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Include un vassoio di elettrodi, portaelettrodi, anodo e catodo, allineatore e coppa campioni bar e coppe campioni. |
| EPS 3501 XL Alimentazione | GE Healthcare | 18-1130-05 | Forniture di tensione fino a 3500 V. |
| Multiphor II elettroforesi Unità | GE Healthcare | 18-1018-06 | Elettrodi mobili consentono IEF in strisce IPG di ogni lunghezza (7-24 centimetri IPG strisce) |
| PerfectBlue gel sistema Doppia S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel formato. Gel da camera comprende un sistema di raffreddamento. |
| Per colloidale Coomassie G-250 colorazione: | |||
| colorazione piatti con coperchi | VWR | 216-3412 | Adatto per mini-gel. Sovrapposte a shaker. |
| solfato di alluminio-18-idrato | Merck | 1.01102.5000 | Abbiamo fatto migliore esperienza con Merck. Appena disponibile in 5 pacchetti kg. |
| ortofosforico | Prolabo | 20 624.295 | Venduto in bottiglie di vetro. |
Riferimenti
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W.
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Ristampe e permessi
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