Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida
Summary
Este vídeo é popularizar uma coloidal Coomassie G-250 protocolo de coloração de acordo com Kang<em> Et al.</em> Para a detecção de proteínas ng média de 4 em géis. A coloração é concluída dentro de duas horas e sem qualquer esforço. Rotineiramente utilizam o protocolo Kang para fins analíticos, de gel com base em proteômica.
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) é um corante comumente usado para a visualização de proteínas separadas por SDS-PAGE, oferecendo um processo de coloração simples e quantificação de altura. Além disso, é totalmente compatível com identificação de proteínas espectrometria de massa. Mas, apesar dessas vantagens, a CBB é considerado para ser menos sensível do que a prata ou colorações de fluorescência e, portanto, raramente usado para a detecção de proteínas em gel analítica abordagens baseadas em proteômica.
Várias melhorias do original Coomassie protocolo 1 foram feitas para aumentar a sensibilidade da CBB. Duas grandes modificações foram introduzidas para aumentar a detecção de proteínas de baixa abundância, convertendo as moléculas de corante em partículas coloidais: Em 1988, Neuhoff e colegas aplicaram 20% de metanol e maiores concentrações de sulfato de amônio no G-250 CBB solução corante com base 2, e em 2004 Candiano et al. estabelecida Prata Azul usando CBB G-250 com ácido fosfórico na presença de sulfato de amônio e metanol 3. No entanto, todas estas modificações apenas permitem uma detecção de aproximadamente 10 ng de proteína. Um protocolo muito obscuro para a coloração Coomassie coloidal foi publicado por Kang et al. Em 2002, onde eles modificaram Neuhoff protocolo de coloração coloidal CBB sobre as substâncias complexantes. Em vez de sulfato de amônio que usaram sulfato de alumínio e metanol foi substituído pelo 4 etanol menos tóxicos. A base de alumínio romance coloração em estudo Kang mostrou sensibilidade superior que detecta tão baixos como 1 ng / banda (fosforilase b) com variação pouca sensibilidade dependendo proteínas.
Aqui, nós demonstrar a aplicação do protocolo de Kang para rápido e sensível coloração Coomassie coloidal de proteínas em fins analíticos. Vamos ilustrar o protocolo rápido e fácil usando géis bi-dimensional realizada rotineiramente em nosso grupo de trabalho.
Protocol
Discussion
Inovadora ou apenas outro protocolo Coomassie?
No momento existem vários protocolos para a coloração de procedimentos com Coomassie Brilliant Blue. A maioria deles o resultado de modificações maiores ou menores de um dos protocolos mais comumente usados por Neuhoff e colegas 2. Também protocolo Kang é baseado na fórmula de Neuhoff. Mas é realmente um método de coloração Coomassie alternativa para a pesquisa proteômica? Vamos imagem duas questões principais, lim…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Nicola Wiethölter para a preparação e coloração de 1-D gels.
Este trabalho foi financiado por uma doação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e apoiado por uma bolsa de pesquisa do Manchot Jürgen Stiftung para ND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
Riferimenti
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
