Endotelial colônia formando células progenitoras (ECFCs) são uma ferramenta promissora para o estudo da homeostase vascular e reparação.<sup> 1,2</sup> Este artigo introduz um novo método de soro animal-livre para isolamento e expansão de ECFC heparinizado de sangue humano adulto periférica com pool de lisado de plaquetas humanas (pHPL) diminuindo o risco de anti-bovino imunização.
Abstract
Este trabalho apresenta uma estratégia de recuperação da novela para colônia de células progenitoras endoteliais formando (ECFCs) de heparinizado mas de outra maneira não-manipulado sangue periférico humano adulto dentro de uma média de 12 dias. Após a expansão em grande escala> 1×10 8 ECFCs pode ser obtido para mais testes. Vantajosamente usando pHPL o contato de células humanas com antígenos soro bovino pode ser excluída. Por citometria de fluxo e imunohistoquímica das células isoladas podem ser caracterizadas como ECFC e sua funcionalidade vitro para formar estruturas vasculares, como pode ser testado em um ensaio de Matrigel. Além disso essas células podem ser subcutânea em um modelo de mouse para forma funcional, vasos perfundidos in vivo. Após a expansão a longo prazo e proliferação de criopreservação, função e estabilidade genômica parecem ser preservada 3,4.
Este isolamento de proteína animal-livre e método de expansão é de fácil aplicação para gerar uma grande quantidade de ECFCs.
Protocol
A.) ECFC ISOLATON DIA 1: Antes de começar a preparar com a experiência da célula endotelial Crescimento meio de cultura Médio-2 (EGM-2). Suplemento 500ml endotelial Basal Medium-2 com heparina (1ml de 1000 U / ml), solução de 100x 5ml de penicilina / estreptomicina (todos Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (concentração final de 2 mM ), e 50 ml de lisado de plaquetas agrupadas humano (pHPL). Em seguida, adicion…
Discussion
Este isolamento romance e método de expansão é um processo simples e eficiente que é mais eficiente e menos morosa, evitando qualquer separação de células (sem gradiente de densidade necessário) e menos caro do que as técnicas convencionais. Por meio de contato pHPL aos antígenos bovina e xenoimmunization subseqüentes putativa é excluído. Durante o período de cultivo pequenos coágulos podem se formar, causada pela pHPL. Baseado em nossa experiência esses coágulos não afetam a formação de colônias e …
Acknowledgements
Os autores agradecem a Dra. Katharina Schallmoser para fornecer pHPL e Margaretha Frühwirth e Daniela Thaler para assistência técnica excelente.
Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).