نقدم بروتوكولات للتغليف (3D) 3 الأبعاد للخلايا داخل الهلاميات المائية الاصطناعية. ويرد الإجراء التغليف لمدة الأساليب المستخدمة عادة من يشابك (مايكل وبالإضافة إلى ذلك النوع الخفيف شرعت آليات الجذور الحرة) ، فضلا عن عدد من التقنيات لتقييم السلوك مغلفة الخلية.
التغليف 3D من الخلايا داخل الهلاميات المائية يمثل تقنية مهمة على نحو متزايد وشعبية لاستنبات الخلايا ونحو تطوير البنى للهندسة الأنسجة. هذا أفضل ما يحاكي البيئة مراقبة الخلايا في الجسم الحي ، بالمقارنة مع زراعة الأنسجة القياسية ، ويرجع ذلك إلى خصائص مثل النسيج والبيئة 3D. البوليمرية الهلاميات المائية الاصطناعية وشبكات المياه تورم التي يمكن أن تكون مصممة لتكون مستقرة أو للحط من خلال التحلل المائي أو التحلل البروتيني كما هو المودعة من قبل خلايا أنسجة جديدة مغلفة. وقد تم استكشاف مجموعة واسعة من البوليمرات لهذه التطبيقات ، مثل بولي (جلايكول الإثيلين) وحامض الهيالورونيك. الأكثر شيوعا ، هو البوليمر functionalized التفاعل مع مجموعات مثل methacrylates أو acrylates قادرة على يشابك تمر من خلال آليات مختلفة. في العقد الماضي ، أحرز تقدم كبير في مجال الهندسة microenvironments هذه — على سبيل المثال ، عن طريق دمج والتساهمية البدني أو قلادة من الاشارات البيوكيميائية — لتحسين سلامة والنمط الظاهري المباشر الخلوية ، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية مغلفة (Burdick وآخرون).
وقد تم تحسين الأساليب التالية لتغليف 3D من الخلايا في مختبراتنا وغيرها من لتعظيم cytocompatibility وتقليل عدد خطوات التجهيز هيدروجيل. في البروتوكولات التالية (انظر الشكل رقم 1 لتوضيح الإجراء) ، فمن المفترض أن البوليمرات functionalized قادرة على يشابك تمر بالفعل في متناول اليد ، ويمكن الاطلاع على آراء ممتازة للكيمياء البوليمرات على النحو المطبق في مجال هندسة الأنسجة في مكان آخر (Burdick وآخرون) ، وهذه الأساليب متوافقة مع مجموعة واسعة من أنواع البوليمر. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى مايكل من نوع (انظر Lutolf وآخرون) وخفيفة بدأت الجذور الحرة (انظر Elisseeff وآخرون.) ركزت على آليات هنا لا تشكل سوى جزء صغير من التقنيات يشابك عنها. يشابك مختلطة واسطة ، والتي استهلكت لأول مرة جزء من رد الفعل من قبل الجماعات يشابك بالإضافة إلى وجود آلية تليها الراديكالية ، هو نموذج آخر استخداما وقوية لتوجيه النمط الظاهري للخلايا مغلفة (Khetan وآخرون ، وآخرون ساليناس).
البروتوكولات المذكورة يمثل طريقة بسيطة وقوية لتغليف الخلايا داخل السقالات هيدروجيل بطريقة cytocompatible. مثل هذه التقنيات أهمية خاصة منذ متباينة عضال والخلايا الجذعية يمكن أن يحمل سلوك مختلف بشكل ملحوظ في مقابل microenvironments 2D 3D. يمكن حتى للنهج العلاجية التي تنطوي على غرس المواد (على سبيل المثال ، في الموقع البلمرة الراديكالية) ، التغليف الخلية وتحليلها من أجل البقاء وتمايز المساعدة في عملية التنمية المادية. يمكن استخدامها في عملية وصفها متتابعة لمعالجة البيئة هيدروجيل مكانيا ، وبالتالي السلوك الخليوي (انظر Khetan وآخرون).
عموما ، فإن أهم عنصر من البروتوكولات المذكورة هو تجانس جميع الحلول المستخدمة. على وجه الخصوص ، ينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان موزعة بالتساوي الخلايا في حل prepolymer ، وهذا هو الحل تمتزج جيدا قبل إعادة تعليق ماصة التالية إضافة الحل crosslinker. يمكن أن فشله في ضمان هذا يؤدي الى تراكمها من الخلايا أو الاختلافات المحلية في الهيكل هلام والتورم.
بينما البروتوكولات المعروضة هنا تركز أساسا على إجراء لتغليف الخلايا ، ومن المهم أن نلاحظ أيضا أن التغليف قد تتطلب بعض التعديل لتحليل البروتوكولات التي تتم كتابتها عادة لبذر 2D. وبرز العديد من الأمثلة عن تصور وتقييم الخلايا في الهلاميات المائية.
وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للزمالة أبحاث العلوم العليا لSK والمعاهد الوطنية للمنح R01EB008722 هيث.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
.2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma | T0449 | |
PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma | P5282 | |
Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
DAPI | Reagent | Sigma | D9542 | |
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences | 23591 | |
Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma | A7030 | |
Tween 20 | Reagent | Sigma | P1379 | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma | T8787 | |
Citrisolv | Reagent | Fisher | 22-143975 | |
Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
1 mL disposable syringes | Equipment | BD biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma | P6800 | |
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | Exfo Life Sciences Division | S1000 | |
254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |