우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 – 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.
hydrogels 내에서 세포의 3D 캡슐은 culturing 세포 및 조직 공학을위한 구조의 개발을 향해 점점 더 중요하고 인기있는 기술을 나타냅니다. 이 환경은 더 인해 조직과 같은 속성과 3D 환경, 표준 조직 문화에 비해 세포가 생체내에서 관찰 무엇 모방한 것이었 지요. 합성 고분자 hydrogels은 안정이나 새로운 조직이 캡슐 세포에 의해 입금 그대로 가수 분해 또는 proteolysis를 통해 저하될 수 있도록 설계 수있는 물을 부었 네트워크입니다. 고분자의 다양한는 같은 폴리 (에틸렌 글리콜)과 hyaluronic 산성 이러한 응용 프로그램에 대해 살펴왔다. 가장 일반적으로, 고분자는 이러한 methacrylates 또는 다양한 메커니즘을 통해 crosslinking를 겪고 수 acrylates 같은 반응 그룹으로 작용합니다. 캡슐 줄기 세포 (. 버딕 외)의 분화를 포함하여 생존과 직접적인 세포 표현형을 개선하기 위해 – 생화 학적 신호의 물리적 또는 펜던트 공유 결합 정관을 통해, 예를 들어 – 지난 10 년간 많은 진전이 엔지니어링이 microenvironments을 이루어왔다.
세포의 3D 캡슐에 대한 다음과 같은 방법 cytocompatibility을 극대화하고 히드로겔 처리 단계의 수를 최소화하기 위해 다른 실험실에서 최적화되었습니다. 다음과 같은 프로토콜 (절차의 그림에 대한 그림 1 참조), 그것은 crosslinking를 겪고 수 기능화 고분자가 손에 이미 것으로 간주됩니다, 같은 조직 공학 분야에 적용 고분자 화학 우수 리뷰는 다른 찾을 수 있습니다 (버딕 외.) 이러한 방법은 폴리머 타입의 범위와 호환됩니다. 또한, 마이클 타입 추가 (Lutolf 외를 참조하십시오.)와 자유 라디칼 (Elisseeff 외를 참조하십시오.) 메커니즘 여기에 초점을 맞춘 가벼운 시작은 보고된 crosslinking 기술의 단지 작은 부분을 구성합니다. 반응 그룹의 일부가 처음 추가 crosslinking에 의해 소비하고 근본적인 메커니즘 뒤에있는 혼합 모드 crosslinking은 캡슐화된 세포 (Khetan 외., 살리 나스 외.)의 표현형를 지시하고 또 다른 일반적으로 사용하고 강력한 패러다임이다.
설명 프로토콜 cytocompatible 방식으로 히드로겔 공사장 공중 발판 내에서 세포를 캡슐로 간단하고 강력한 방법을 나타냅니다. 말기 차별화된 이후 이러한 기술은 특히 중요하고 줄기 세포는 2D 3D microenvironments에 비해 현저하게 다른 동작을 수 있습니다. 도 자료의 주입 (예에서 현장 급진 중합), 세포 캡슐화 및 생존과 차별에 대한 분석을 포함하는 치료 방법에 대한 소재 개발 과정에서 도움이 될 수 있습니다. 설명 순차 프로세스 공간 히드로겔 환경을 조작하는 데 사용하고, 따라서 세포의 행동 (Khetan 외를 참조하십시오.)하실 수 있습니다.
전체 설명 프로토콜의 가장 중요한 요소는 사용되는 모든 솔루션의 균질성입니다. 특히, 특별한주의가 crosslinker 솔루션뿐만 아니라 다음 피펫 resuspension에 의해 세포가 균일하게 예비 중합체 솔루션에 배포하고 있으며, 해결이 잘 혼합되도록로 이동해야합니다. 이것을 보장하기 위해 실패하면 셀 또는 겔 구조와 붓기 지역 유사 clumping 발생할 수 있습니다.
프로토콜 여기 캡슐 세포에 대한 절차에 주로 초점을 제시하지만, 그것은 캡슐 일반적으로 2D 시딩용으로 작성된 분석 프로토콜을 일부 조정이 필요한 수도주의하는 것이 중요합니다. 몇 가지 예제가 hydrogels에 세포를 시각화 및 평가를위한 그림했다.
이 작품은 SK와 히스 부여 R01EB008722 국립 연구소에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
.2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma | T0449 | |
PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma | P5282 | |
Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
DAPI | Reagent | Sigma | D9542 | |
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences | 23591 | |
Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma | A7030 | |
Tween 20 | Reagent | Sigma | P1379 | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma | T8787 | |
Citrisolv | Reagent | Fisher | 22-143975 | |
Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
1 mL disposable syringes | Equipment | BD biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma | P6800 | |
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | Exfo Life Sciences Division | S1000 | |
254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |