Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Summary

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren<em> In vivo</em>. Hier präsentieren wir eine neuartige<em> In-vitro-</em> Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Abstract

Sequencing RNAs, dass die Zusammenarbeit Immunopräzipitat (Co-IP) mit RNA-bindende Proteine ​​hat unser Verständnis von Spleißen durch den Nachweis, dass die Bindung Standort erhöht oft Einflüsse Funktion eines Spleißfaktor. Doch wie bei jeder Strategie der Probenahme ist die Chance, eines RNA gebunden an eine Spleißfaktor ist proportional zu seiner zellulären Hülle und Fülle. Wir haben ein neues in vitro-Ansatz für die Vermessung Bindungsspezifität auf sonst vorübergehende pre-mRNA entwickelt. Dieser Ansatz nutzt eine speziell Oligonukleotid-Pool, Fliesen in Introns, Exons, Spleißstellen oder anderen pre-mRNA. Der Pool ist eine Art molekulare Selektion unterzogen. Hier zeigen wir die Methode durch die Trennung der Oligonukleotid in einen gebundenen und ungebundenen Fraktion und nutzen zwei Farb-Array-Strategie, um die Anreicherung von jedem Oligonukleotid in der gebundenen Fraktion aufzunehmen. Die Array-Daten erzeugt hochauflösende Karten mit der Fähigkeit zu identifizieren Sequenz-spezifische und strukturelle Bestimmtheiten der ribonucleoprotein (RNP) verbindlich pre-mRNA. Ein einzigartiger Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, die Probenahme Ausrichtung auf mRNA mit aktuellen IP und SELEX Techniken verbunden zu vermeiden, da der Pool speziell entwickelt wurde, und von prä-mRNA-Sequenz synthetisiert. Die Flexibilität der Oligonukleotid-Pool ist ein weiterer Vorteil, da der Experimentator wählt, welche Regionen zu studieren und Fliesen auf, Schneiderei am Pool auf ihre individuellen Bedürfnisse. Mit dieser Technik kann man Assay die Auswirkungen von Polymorphismen oder Mutationen auf die Bindung im großen Maßstab oder Klon der Bibliothek in einen funktionalen Spleißen Reporter und identifizieren Oligonukleotide, sind im Lieferumfang enthalten Fraktion angereichert. Dieser Roman in vitro hochauflösenden Kartierung Programm bietet die einzigartige Möglichkeit, RNP Interaktionen mit transienten pre-mRNA-Spezies, deren geringer Menge macht es schwer, sich mit aktuellen In-vivo-Techniken zu studieren.

Protocol

Pool Design und Oligo Erholung Der erste Schritt ist, die pre-mRNA-Pool Design studiert werden. Dies kann mit Hilfe der UCSC Genome Browser und das Herunterladen bestimmter Gene, Spleißstellen oder anderen Bereichen von Interesse sein. Sobald die Fenster von Interesse ausgewählt wurden, Fliesen über sie rechnerisch unter den folgenden Bedingungen: read Länge sollte 30 Nukleotiden mit einer 10 Nukleotid überlappen, so daß jeder Oligo ist 20 Nukleotide aus dem Stand eins verschoben werden. * Oli…

Discussion

Wenn Sie dieses Verfahren ihr wichtig, dass die Schöpfung des Pools erinnere, ist flexibel und offen für Veränderungen entweder an der RNA-oder Protein-Ebene. Bei der RNA-Ebene orthologen Regionen, Krankheit Mutationen, Polymorphismen oder Mutationen können in der Oligonukleotid-Sequenz eingeführt werden. Bei der Protein-Ebene der RNA-Bindung Faktor kann durch Phosphorylierung oder andere post-translationale Modifikationen verändert werden. Darüber hinaus kann die Bindung Umfeld manipuliert werden, um entweder er…