Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Summary

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y estudiar<em> In vivo</em>. A continuación, presentamos una novela<em> In vitro</emEnfoque> para investigar las interacciones proteína-ARN utilizando un oligo piscina sintéticos que los azulejos de todas las regiones seleccionadas de pre-mRNA.

Abstract

Secuenciación ARN que co-immunoprecipitate (co-IP) con las proteínas de unión a ARN ha aumentado nuestra comprensión de empalme mediante la demostración de que la ubicación de unión a menudo influye en la función de un factor de empalme. Sin embargo, como con cualquier estrategia de muestreo la posibilidad de identificar un ARN unido a un factor de empalme es proporcional a su abundancia celular. Hemos desarrollado un nuevo enfoque in vitro para la topografía especificidad de unión de otra manera transitoria pre-mRNA. Además, utiliza un conjunto específicamente diseñado oligonucleótidos que los azulejos a través de los intrones, exones, los cruces de empalme, o pre-mRNA. La piscina está sometido a algún tipo de selección molecular. Este sentido, demuestran el método por el que separa el oligonucleótido en una fracción unido y sin unir y utilizar una estrategia de dos colores matriz para registrar el enriquecimiento de cada oligonucleótido en la fracción unida. El conjunto de datos genera mapas de alta resolución con la capacidad de identificar la secuencia específica y estructurales determinantes de la ribonucleoproteína (RNP) de la unión de pre-mRNA. Una ventaja única de este método es su capacidad para evitar el sesgo de muestreo hacia el ARNm relacionados con IP y técnicas actuales SELEX, ya que la piscina está específicamente diseñado y sintetizado a partir de la secuencia pre-mRNA. La flexibilidad de la piscina de oligonucleótidos es otra ventaja, ya que el investigador elige qué regiones de estudio y el azulejo en todo, la adaptación de la piscina para sus necesidades individuales. Usando esta técnica, se puede ensayo de los efectos de los polimorfismos o mutaciones en la unión a gran escala o la clonación de la biblioteca en un reportero de empalme funcionales e identificar los oligonucleótidos que se enriquecen en la fracción incluidos. Esta novela in vitro de alta resolución esquema de mapeo ofrece una forma única para estudiar las interacciones con RNP transitoria pre-ARNm especies, cuya baja abundancia hace difícil su estudio con las actuales técnicas in vivo.

Protocol

Piscina de diseño y recuperación de oligo El primer paso es el diseño de la piscina pre-mRNA en estudio. Esto se puede hacer uso de la UCSC Genome Browser y la descarga de determinados genes, los cruces de empalme, o otras áreas de interés. Una vez que las ventanas de interés han sido seleccionados, el azulejo a través de ellos computacional usando las siguientes condiciones: longitud lectura debe ser de 30 nucleótidos con una superposición de 10 nucleótidos, por lo tanto, cada oligo se de…

Discussion

Al realizar este procedimiento es importante recordar que la creación de la piscina es flexible y abierto a modificaciones, ya sea en el ARN o la proteína. A nivel del ARN orthologous regiones, las mutaciones de la enfermedad, los polimorfismos o mutaciones aleatorias pueden ser introducidos en la secuencia de oligonucleótidos. En el nivel de proteína del factor de unión a ARN pueden ser modificados por fosforilación u otras modificaciones post-traduccional. Además, el medio ambiente de unión puede ser manipulad…