激活的B细胞CD40的小鼠模型

Summary

在这个视频中，我们展示的CD40从C57BL / 6小鼠的脾细胞，它可以用来作为模型抗原提呈细胞（APC）的研究免疫诱导小鼠的B细胞的活化和扩大的过程。

Abstract

有研究表明，B细胞CD40的激活提高其抗原提呈能力。当白细胞介素4和CD40配体（CD40L）的刺激下，没有非常大量高纯度的CD40 – B细胞（14天之内的困难，从少量外周血的可扩展人类B细胞> 10⁹细胞每名患者），从健康的捐赠者以及癌症患者^1-4。 CD40 – B细胞表达重要的淋巴结归巢的分子，可以吸引T细胞<em>在体外</em⁵。此外，他们采取有效，过程和目前的T细胞抗原^6,7。 CD40 – B细胞被证明不仅总理天真，但也扩大记忆性T细胞^8,9。因此，CD40 -激活的B细胞（CD40 – B细胞）进行了研究，作为一种替代源免疫刺激抗原提呈细胞（APC），基于细胞immunotherapy1，5,10。为了进一步研究是否CD40 – B细胞诱导有效的T细胞在体内的反应和我们建立了小鼠CD40激活的B细胞产生的细胞培养系统研究的基础机制。使用脾细胞或纯化C57BL / 6小鼠的B细胞CD40的激活，确定了最佳工艺条件如下：开始的C57BL / 6小鼠淋巴细胞（单体型H – 2B）的脾细胞密度梯度离心法和HeLa细胞共同培养纯化重组鼠CD40配体（tmuCD40L的HeLa细胞表达）¹¹。细胞是再培养每隔3-4天，和关键部件，如CD40L，白细胞介素- 4 -巯基乙醇和环孢素A的补充。在这个协议中，我们演示了如何获得类似的APC -表型的人CD40 B细胞（图1A，B）完全激活的小鼠的CD40 – B细胞（mCD40B）。 CD40的刺激会导致快速的生长和细胞培养在14天的高纯度（> 90％），CD19 + B细胞的扩张（图1C，D）​​。为了避免污染与非转染的细胞，小鼠CD40的配体的转染表达经常被控制（图2）。小鼠CD40激活的B细胞可用于研究B细胞的活化和分化，以及调查他们的潜能作为APC，在体内和体外的功能。此外，他们代表了建立抗肿瘤治疗或预防接种有前途的工具，将有助于回答问题，这种方法的安全性和免疫原性¹²。

Protocol

协议分为两个部分：第一部分为一代小鼠CD40激活的B细胞（脾mCD40B）一个演示小鼠CD40配体（CD40L）表达HeLa细胞（tmuCD40L HeLa细胞），这将被用作板准备束缚饲养层细胞。 B部分介绍了实际的小鼠CD40 – B的文化。 A.制备饲养细胞（HeLa细胞tmuCD40L） tmuCD40L HeLa细胞是一个附着的人类上皮细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以…

Discussion

本协议的修改是可能的，尤其是关于CD40的刺激和使用的小鼠品系类型的起源，也高产高效代小鼠CD40激活的B细胞。艾哈迈迪等人。表明小鼠CD40的配体转染小鼠成纤维细胞类似的结果。可以肯定地排除在这种异种抗原的背景下演示，但在体内的安全性和毒性的深入研究了在此设置使用人类转染的HeLa细胞的炎症或自身免疫反应的迹象。然而，最好的替代代表与激活和增殖活动在同一时间，这?…

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium	Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
RPMI 1640		RPMI 1640
L-Glutamine	300 μg/mL	L-Glutamine	300 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		Hygromycin B	0.2 mg/mL

mCD40-B washing medium	mCD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
D-MEM		D-MEM
L-Glutamine	580 μg/mL	L-Glutamine	580 μg/mL
Glucose	4.5 mg/mL	Glucose	4.5 mg/mL
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		MEM	0.1mM (1x)
		FBS	10%

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
RPMI 1640	Invitrogen Gibco®	REF 21875
D-MEM	Invitrogen Gibco®	REF 41965
Dulbecco´s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
MEM NEAA	Invitrogen Gibco®	REF 11140
Hygromycin B	PAA	Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4	Immunotools	Cat No 12340045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	Sarstedt	Cat No 83.1813.002