B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス
Summary
このビデオでは、我々は、CD40 -活性化と免疫の誘導を研究するためにモデル抗原提示細胞（APC）として使用することができますC57BL / 6マウスの脾臓細胞からマウスB細胞、の拡張の手順を示しています。
Abstract
B細胞の研究は、CD40の活性化が、その抗原提示能を改善することが示されています。インターロイキン-4およびCD40リガンド（CD40L）で刺激したとき、ヒトB細胞は、高純度のCD40 – B細胞の非常に大きな金額に14日以内に末梢血の少量から困難なく拡張することができます（> 10<sup> 9</sup健康なドナーだけでなく、癌患者から患者あたり>細胞）<sup> 1月4日</sup>。 CD40 – B細胞が重要なリンパ節ホーミング分子を発現し、T細胞を引き付けることができる<em> in vitroで</em<sup> 5</sup>。さらに彼らは、効率的にT細胞に、プロセスと存在する抗原を取る<sup> 6,7</sup>。 CD40 – B細胞は素数ナイーブではないだけに示して、だけでなく、メモリーT細胞を展開していた<sup> 8,9</sup>。したがって、CD40活性化B細胞（CD40 – B細胞）の細胞ベースのimmunotherapy1、5,10のための免疫刺激抗原提示細胞（APC）の代替源として研究されている。 CD40 – B細胞はin vivoで効果的なT細胞応答を誘導し、我々はマウスのCD40活性化B細胞の産生のために細胞培養系を確立し、基礎となるメカニズムを研究するかどうかをさらに研究するために。脾細胞を用いてまたはCD40 -活性化のためのC57BL / 6マウス由来のB細胞を精製し、最適な条件は次のように同定された：C57BL / 6マウス（ハプロタイプH – 2b）はリンパ球の脾臓細胞からの起動は、密度勾配遠心法により精製し、HeLa細胞と共培養されています組換えマウスCD40リガンド（tmuCD40L HeLa細胞）を発現する細胞<sup> 11</sup>。細胞は3-4日ごとにreculturedされており、そのようなCD40L、インターロイキン-4のような主要なコンポーネントは、-メルカプトエタノールおよびサイクロスポリンが補充されています。このプロトコルでは、ヒトCD40 – B細胞（図1A、B）と同様のAPC -表現型と完全に活性化マウスCD40 – B細胞を（mCD40B）を取得する方法を示しています。 CD40刺激は、急速な伸長や細胞培養の14日以内に高純度（> 90％）CD19 + B細胞（図1C、D）の拡大につながる。非トランスフェクト細胞の混入を避けるために、トランスフェクタントでマウスCD40リガンドの発現は、（図2）定期的に制御する必要があります。マウスCD40活性化B細胞はB細胞の活性化と分化と同様にin vitroおよびin vivoにおけるAPCとして機能する潜在能力を調査するための研究に使用することができます。また、彼らは腫瘍に対する治療剤又は予防接種を確立するための有望なツールを示しており、このアプローチの安全性と免疫原性に関する質問に答えるために役立ちます。<sup> 12</sup>。
Protocol
Discussion
このプロトコルの変更も、マウスCD40活性化B細胞の効率的な世代に降伏、特にCD40刺激し、使用されるマウス系統のタイプの起源について、可能な限りされています。アフマディら。 CD40 -リガンドマウスでトランスフェクションしたマウス線維芽細胞に対して同様の結果が示されている。このコンテキストでは外来の抗原の提示を確実に除外されますが、in vivoでのセキュリティと毒性?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは親切tmuCD40 – リガンド- HeLa細胞細胞株を提供するために博士はクレメンスWendtnerに感謝。
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Riferimenti
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
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- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
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- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
