의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여
Summary
비옥하게하는 절차<em> Xenopus의 oocytes</em> 호스트 전송 방식.
Abstract
초기 개발을 척추에 maternally 상속 분자의 기여를 공부하는 것은 종종 산모 효과 돌연변이 동물을 생성하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해합니다. 또한, 이러한 Xenopus 및 zebrafish 같은 생물의 유전자 기능을 overexpress하거나 억제하는 기술의 대부분은 충분히 이러한 Wnt 신호 전달과 같은 중요한 산모 신호 경로를 대상으로 실패합니다. Xenopus에서 교양 oocytes에서 유전자 기능을 조작하고 이후에 그들을 풍부하게하는 것은 어느 정도 이러한 문제를 개량하다 수 있습니다. Oocytes 수동, 기증자의 난소 조직에서 defolliculated 원하는대로 주입이나 문화에 취급하고 성숙을 유도하기 위해 progesterone로 자극하고 있습니다. 그들은 숙주의 수란관을 통해 translocated 및 수정과 수정에 필요한 젤리 코팅을 획득한다 뭘로 다음 oocytes는 앤 호스트 여성 개구리의 뱃속에 소개합니다. 그 결과 태아는 다음 원하는 단계로 사육하고 실험 perturbations의 효과에 대한 분석하실 수 있습니다. 이 호스트 전송 방식은 초기 발달의 기본 메커니즘을 잠복에 매우 효과적 및 기타 척추 모델 생물에서 사용할 수없는 실험적인 가능성의 다양한 수 있습니다.
Protocol
Discussion
성공적인 전송 수정 및 oocytes의> 50 % (그림 3)의 정상적인 절단을 초래할 것입니다. 양도 oocytes 일반적으로 사이 30~60%는 neurula 단계 과거 살아남을 것입니다. 우리는 보통 75-150 분석 여러 종류의 충분한 배아를 얻을 것입니다 실험적 그룹당 oocytes (현장에서 RT – PCR)뿐만 아니라 표현형를 시각화를 전송합니다. 실질적으로 더 oocytes을 이온 주입하면 크게 수율을 증가하지 않는 것. 또한, 그룹 당 적?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고의 중요한 독서를위한 휴스턴 연구실의 감사 회원 싶습니다. 연구 DWH에게 수여 국립 보건원 (GM083999)에 의해 지원됩니다
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
Riferimenti
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. . Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a ‘dorsal signal’ in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).
