Оплодотворение Xenopus ооцитов Использованием метода передачи хост
Summary
Процедура для удобрения<em> Xenopus ооцитов</em> По методу передачи хосту.
Abstract
Изучение вклада матерински унаследовал молекул позвоночных раннего развития часто препятствует времени и средств, необходимых для создания материнского эффекта мутанта животных. Кроме того, многие методы гиперэкспрессией или подавляют функции генов в организмах, таких как Xenopus и данио не в состоянии достаточно критическое целевой материнской сигнальных путей, таких как Wnt сигнализации. В Xenopus, манипулируя функции генов в культуре ооцитов, а затем удобрения них могут улучшить эти проблемы в некоторой степени. Ооциты вручную defolliculated из донорской ткани яичника, вводят или обработаны в культуре по своему желанию, а затем стимулировали прогестерон, чтобы вызвать созревание. Далее ооциты вводят в полость тела овуляция хост женщины лягушки, после чего они будут перемещаться через яйцевод хозяина и приобрести модификации и желе пальто необходимые для оплодотворения. В результате эмбрионов может быть увеличена до желаемой сцены и проанализированы последствия любых экспериментальных возмущений. Этот узел передачи метод был очень эффективен при выявлении основных механизмов раннего развития и позволяет широкий спектр экспериментальных возможностей не доступны в любой другой организм модель позвоночных.
Protocol
Discussion
Успешная передача приведет к оплодотворению и нормального расщепления> 50% ооцитов (рис. 3). Обычно между 30-60% от переводимой ооцитов выживет прошлого этапа нейрулы. Мы обычно передачи 75-150 ооцитов в экспериментальной группе, которая даст достаточно эмбрионов в течение нескольких типов ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить благодарность членам лаборатории Хьюстон для критическое прочтение рукописи. Исследование проводится при поддержке Национального института здоровья (GM083999) присуждена DWH
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
Riferimenti
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. . Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a ‘dorsal signal’ in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).
