Summary
Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.
Abstract
Het ontrafelen van de interactie netwerk van moleculen
Protocol
Microcontact Afdrukken:
- Knip gebied van micropattern van de PDMS stempel met behulp van een scalpel
- Was het veld met de micropattern door deze te spoelen met ethanol (100%) en gedestilleerd water.
- Droog de PDMS stempel met stikstof of argon gas.
- Pipetteer 50 ul BSA-Cy5 werk-oplossing (0,67 mg / ml) op de PDMS stempel zodat de hele micropattern veld is bedekt met oplossing. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de micropattern veld door te spoelen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gedestilleerd water.
- Droog de PDMS met stikstof of argon gas.
- Plaats de PDMS stempel onder zijn eigen gewicht op het midden van een epoxy-coating dekglaasje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een petrischaal.
- Label de positie van de PDMS stempel op de achterkant van de dekglaasje en strip de stempel van de dia met een pincet.
- Stick een Secure Seal Hybridisatie kamer over de microcontact gedrukt veld op het dekglaasje. Het label helpt bij het lokaliseren het midden van het veld.
- Pipetteer 60 ul streptavidine werk-oplossing (50 ug / ml) in de reactie kamer en incubeer het monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Was het monster met 1 ml PBS door het toevoegen van de buffer in een poort van de kamer en het verwijderen van het tegelijkertijd op de tweede poort met een pomp.
- Pipetteer 60 ul gebiotinyleerd antilichaam werk-oplossing (10 ug / ml in PBS aangevuld met 0,1% Tween 20; "PBST") in de reactie kamer en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Was het monster met 1 ml PBST en vervolgens 1 ml PBS door het toevoegen van de buffer in een poort van de kamer en het verwijderen van het weer op de tweede poort met een pomp.
- Bewaar de micropatterned oppervlakken in PBS in het donker bij kamertemperatuur totdat cellen zijn klaar voor het zaaien.
Incubatie van de cellen op het oppervlak micropatterned:
- Grow hechtende cellen tot 50% confluentie in een 3 cm weefselkweek plaat.
- Los cellen die lokaas en prooi eiwitten van belang met Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing en centrifugeer 5 min bij 1000 rpm.
- Verwijder het supernatant en los de cel pellet in de volgens groeimedium.
- Centrifugeer 5 min bij 1000 rpm.
- Verwijder het supernatant en los de celpellet in de juiste groeimedium.
- Wisselen de PBS van de reactie kamer op de micropatterned dekglaasje met 60 ul van de celsuspensie.
- Maak een vochtige kamer door het weken een steriel gaasje in gedestilleerd water en het in het petrischaaltje het monster te voorkomen dat drooglopen.
- Incubeer de cellen over-nacht bij 37 ° C in een 5% CO 2 sfeer op het micropatterned oppervlakken.
- Voor het analyseren van de cellen op de microscoop, wisselen het medium door gebufferde zoutoplossing Hank s waaronder Ca 2 + en Mg 2 +.
Microscopie:
- Het dekglaasje wordt geplaatst op een geschikte mount en de cel morfologie wordt gecontroleerd onder wit licht.
- De kwaliteit van de BSA-Cy5 patronen wordt gecontroleerd door excitatie bij 647 nm.
- Micropatterns van TL-prooi eiwit (GFP of YFP) worden gewaardeerd tegen 488 of 514 nm onder Total Internal Reflection (TIR) excitatie.
Representatieve resultaten:
Als er interactie tussen het doelwit eiwitten in cellen gekweekt op een micropatterned oppervlak, zal de prooi volgen het aas herverdeling. De resulterende micropattern kan worden gevisualiseerd door de fluorescentie label van de prooi eiwit. Belangrijk is dat de verkregen contrast biedt een directe maat voor de interactie sterkte (zie figuur 1). Daarom is een eenvoudige evaluatie van de interactie van twee eiwitten mogelijk wordt - zonder de noodzaak van verdere verwerking van de gemeten primaire gegevens.
Figuur 1. Herinrichting van het aas in de levende cellen plasmamembraan in verschillende sterktes interactie. TIR-beelden van de T24-cellen getransfecteerd met (een), CD71-GFP op CD71-antilichaam, (b) CD4 en cytosolische YFP op CD4-antilichaam en (c) GPI-GFP-DAF op de CD59-antilichaam microbiochips worden weergegeven. De gegevens zijn kenmerkend voor sterke (een), geen (b) of zwakke interactie (c). (A) is overgenomen uit (Weghuber et al.., In press), (b) uit (Schwarzenbacher et al.., 2008).
Discussion
De bijhorende video toont een methode voor het detecteren van eiwit-eiwit interacties in de plasma-membraan van levende cellen (Schwarzenbacher et al., 2008;. Brameshuber et al., 2009;.. Weghuber et al., in press). In principe kan elk TIRF-gebaseerde microscopie platform worden gebruikt als uitlezen systeem. Alleen wanneer een hoge gevoeligheid is gewenst (bijvoorbeeld voor het opsporen van enkele moleculen), zullen geavanceerde microscopen nodig zijn. Om dit te bereiken de beste resultaten de volgende kritieke punten tijdens de voorbereiding vereisen speciale aandacht:
- Store Cy5-stock-oplossing onder donkere omstandigheden om te voorkomen dat bleken van de fluorofoor en vers bereiden van de BSA-Cy5 werken oplossing voor de microcontact afdrukken.
- Let erop dat u de micropattern kras op de PDMS met de pipetpunt en het monster onder donkere omstandigheden om te voorkomen dat bleken van de fluorofoor incuberen.
- Doe de dekglaasje op een steriel gaasje om plakken te voorkomen van het glaasje aan de petrischaal. Zodra de PDMS stempel heeft gehandeld op grond van het glas glijden, niet verplaatsen.
- Voorkomen dat luchtbellen in de reactie kamer en incubeer het monster onder donkere omstandigheden om te voorkomen dat bleken van de fluorofoor.
- Niet laten de steekproef drogen meer dan 2 minuten om de vorming van zoutkristallen te voorkomen.
- Voor het losmaken van de cellen geen gebruik maken van trypsine omdat het klieven het extracellulaire domein van tot nu toe tot uitdrukking membraaneiwitten. Het vermijden van trypsine zal nuttig zijn voor eiwitten met een lage omloopsnelheid te micropatterns formulier direct na bevestiging van de cellen op het oppervlak.
- Controle het aantal ingelegde cellen in een microscoop en zorg ervoor dat cellen niet meer dan 30-50% confluentie bereiken. Zorg ervoor dat excessieve cellen direct worden verwijderd als gevolg van de snelle bevestiging van cellen op het antilichaam-gecoate oppervlak.
- Alleen dia's met een hoge kwaliteit BSA-Cy5 patronen kan worden gebruikt voor verdere analyse.
- Stabiele expressie van het fluorescerende eiwit prooi heeft de voorkeur te wijten aan een groter aantal cellen dat kan worden geanalyseerd per scan.
- Adequate TIRF aanpassing is noodzakelijk om patronen te wijten aan cytosolische achtergrond te visualiseren.
De micro-patronen techniek biedt verschillende mogelijkheden voor de analyse van eiwit-eiwit interacties. Ten eerste, samen met de kwantificering van de lokale, ruimtelijk opgelost eiwit-eiwit interacties ook het opsporen van zwakke of indirecte interacties mogelijk is zonder het nadeel van het geven van een groot aantal valse positieven of negatieven. Ten tweede stelt de onderzoeker om eiwit-eiwit interacties te analyseren in de plasma-membraan van levende cellen, die moeilijk te bereiken is door biochemische methoden, zoals de twee-hybride scherm. Ten derde is de aanpak maakt het mogelijk voor de detectie van aas-prooi interacties die worden gemoduleerd door veranderingen in het milieu, zoals de temperatuur, de aanwezigheid van verschillende eiwitten of andere moleculen of post-translationele modificaties. Dus de test maakt voor de screening modulatoren van een bepaalde interactie paar in de context van levende cellen. Bovendien, door het verminderen van de oppervlakte dichtheid van de vangst ligand of het gebruik van monovalente liganden, de analyse van de toestand van rust wordt het mogelijk te maken. Tot slot, als er voldoende scanplatformen worden gebruikt, het aantal geanalyseerde cellen hoog genoeg is om high throughput eisen van de farmaceutische bedrijven voor drug discovery (Ramm, 2005) match.
Disclosures
De video bevat beelden die werden geleverd door Olympus, genomen vanaf de homepage van de Visualisatie Research Lab, Brown University of overgenomen uit (Kim et al.., 2003).
Acknowledgments
We willen graag Quentina Beatty, Universiteit van Linz, Oostenrijk, bedanken voor haar vriendelijke hulp, Katharina Strub, Universiteit van Genève, Zwitserland, voor de hCD71-GFP te bouwen, en Daniel Legler, Universiteit van Konstanz, Zwitserland, voor het GPI-GFP DAF-construct. Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, project Y250-B03) en het GEN-AU-project van het Oostenrijkse ministerie van Wetenschap en Onderzoek.
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
