Summary
Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.
Abstract
Desvendar a rede de interação de moléculas
Protocol
Impressão microcontact:
- Cortar campo de micropattern do selo PDMS utilizando um bisturi
- Lave o campo que contém o micropattern através de lavagem com etanol (100%) e água destilada.
- Seque o selo PDMS com nitrogênio ou gás argônio.
- Pipetar 50 ul BSA-Cy5 solução de trabalho (0,67 mg / ml) para o selo de PDMS para que o campo micropattern inteiro é coberto com a solução. Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
- Lavar o campo micropattern através de lavagem com Tampão fosfato salino (PBS) e água destilada.
- Seque o PDMS com nitrogênio ou gás argônio.
- Coloque o selo PDMS sob seu próprio peso sobre o centro de uma lamela epoxy revestido e incubar por 30 min à temperatura ambiente numa placa de Petri.
- Rotular a posição do carimbo PDMS na parte traseira da lamela e tira o selo do slide com uma pinça.
- Vara uma câmara de hibridação Seguro Selo sobre o campo microcontact-impresso na lamela. O rótulo de ajuda para localizar o centro do campo.
- Pipetar 60 mL de solução de trabalho estreptavidina (50 mcg / ml) para a câmara de reação e incubar a amostra por 60 min em temperatura ambiente.
- Lavar a amostra com 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo simultaneamente a segunda porta com uma bomba.
- Pipetar 60 mL de solução de trabalho biotinilado anticorpo (10 mg / ml em PBS suplementado com 0,1% Tween 20; "PBST") para a câmara de reação e incubar por 60 min em temperatura ambiente.
- Lavar a amostra com 1 ml PBST e, posteriormente, 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo novamente na segunda porta com uma bomba.
- Armazenar as superfícies micropatterned em PBS no escuro à temperatura ambiente até que as células estão prontos para a semeadura.
Incubação de células na superfície micropatterned:
- Cultivar células aderentes à confluência de 50% em um 3 centímetros placa de cultura de tecidos.
- Separar células que expressam a isca presa e proteínas de interesse, com solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e centrifugar 5 min a 1.000 rpm.
- Desprezar o sobrenadante e dissolver o celular em meio de crescimento de acordo.
- Centrifugar 5 min a 1.000 rpm.
- Desprezar o sobrenadante e dissolver o pellet celular em meio de crescimento adequado.
- Trocar o PBS da câmara de reação na lamela micropatterned em 60 mL da suspensão de células.
- Criar uma câmara úmida por imersão uma almofada em água destilada estéril e colocá-lo na placa de Petri para evitar que a amostra de funcionamento a seco.
- Incubar as células ao longo da noite a 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO 2 na superfície micropatterned.
- Antes de analisar as células no microscópio, a troca do meio de solução de Hank s sal tamponado incluindo Ca 2 + e Mg 2 +.
Microscopia:
- A lamínula é colocada sobre um suporte adequado ea morfologia das células é verificada em branco-luz.
- A qualidade da BSA-Cy5 é marcada por padrões de excitação em 647 nm.
- Micropadrões de proteína presa fluorescente (GFP ou YFP) são registrados a 488 ou 514 nm sob Total Internal Reflection excitação (TIR).
Resultados representativos:
Se não houver interação entre as proteínas-alvo em células cultivadas em uma superfície micropatterned, a presa vai seguir a redistribuição isca. O micropattern resultante pode ser visualizado pelo rótulo de fluorescência da proteína presa. Importante é que o contraste obtido fornece uma medida direta da força de interação (ver Figura 1). Portanto, uma simples avaliação da interação de duas proteínas torna-se possível - sem a necessidade de continuar a processar os dados medidos primária.
Figura 1. Rearranjo da isca na membrana plasmática de células vivas em dosagens diferentes de interação. Imagens TIR de células transfectadas com T24 (a) CD71-GFP em anticorpos CD71, (b) CD4 e YFP citosólica em CD4-anticorpo e (c) GPI-GFP-DAF em anticorpos CD59 microbiochips são mostrados. Os dados são característicos para a forte (a), não (b) ou interação fraca (c). (A) é reproduzida a partir de (Weghuber et al., No prelo), (b) a partir de (Schwarzenbacher et al., 2008).
Discussion
O vídeo que acompanha demonstra um método para a detecção de interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Em princípio, qualquer plataforma de microscopia TIRF baseada pode ser usado como sistema de leitura. Somente quando de alta sensibilidade é desejada (por exemplo, para a detecção de moléculas simples), microscópios avançados serão necessários. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem uma atenção especial:
- Solução de loja Cy5 estoque em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo e preparar o BSA-Cy5 solução de trabalho imediatamente antes da impressão microcontact.
- Tenha cuidado para não arranhar a micropattern no PDMS com a ponta da pipeta e incube a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo.
- Coloque a lamínula sobre uma almofada esterilizada para evitar que grudem da lâmina de vidro para a placa de Petri. Uma vez que o carimbo de PDMS se adere à lâmina de vidro, não movê-lo.
- Evite bolhas de ar na câmara de reação e incubar a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo.
- Não deixe que a amostra seca por mais de 2 minutos para evitar a formação de cristais de sal.
- Para o desprendimento das células não utilizar de tripsina, uma vez que irá unir o domínio extracelular de proteínas da membrana, até agora manifestado. Evitando tripsina será útil para proteínas com baixo índice de rotatividade para formar micropadrões imediatamente após fixação das células na superfície.
- Controlar o número de células incubadas em um microscópio e certifique-se que as células não alcançam mais do que 30-50% confluência. Certifique-se que as células excessivo são removidos imediatamente, devido à fixação rápida de células na superfície revestidos com anticorpo.
- Slides apenas com alta qualidade BSA-Cy5 padrões podem ser usados para análise posterior.
- Expressão estável da proteína fluorescente presa é preferível devido à maior número de células que podem ser analisados por varredura.
- Ajuste TIRF adequada é indispensável para visualizar padrões devido ao fundo citosólica.
A técnica de micro-padronização oferece diversas possibilidades para a análise das interações proteína-proteína. Em primeiro lugar, juntamente com a quantificação do local, espacialmente resolvidos interações proteína-proteína também a detecção de interações fracas ou indirecta é possível sem a desvantagem de dar um elevado número de falsos positivos ou negativos. Em segundo lugar, permite ao pesquisador analisar interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas, que é difícil de conseguir por abordagens bioquímicas como a tela de 2 híbridos. Em terceiro lugar a abordagem permite a detecção de isca presa interações que são modulados por mudanças ambientais, como a temperatura, a presença de diferentes proteínas ou outras moléculas ou modificações pós-translacionais. Assim, o ensaio permite a moduladores de triagem de um par de interação dada no contexto de células vivas. Além disso, ao reduzir a densidade de superfície do ligante captura ou o uso de ligantes monovalentes, a análise do estado de repouso se torna possível. Finalmente, se adequado plataformas de digitalização são utilizados, o número de células analisadas é alta o suficiente para atender as demandas de alto rendimento das empresas farmacêuticas para a triagem de drogas (Ramm, 2005).
Disclosures
O vídeo contém imagens que foram fornecidos pela Olympus, a partir da homepage do Laboratório de Pesquisa Visualization, da Universidade Brown ou reproduzidas a partir de (Kim et al., 2003).
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Quentina Beatty, da Universidade de Linz, na Áustria, por sua ajuda tipo, Katharina Strub, Universidade de Genebra, na Suíça, para a construção hCD71-GFP, e Legler Daniel, Universidade de Konstanz, na Suíça, para o GPI-GFP DAF-construir. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Austríaco (FWF; projeto Y250-B03) eo projeto GEN-AU do Ministério Federal Austríaco da Ciência e Investigação.
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.