Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tillverkning av grafenbelagda nät i monolager för kryoelektronmikroskopi

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65702
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Structural and Computational Biology, Scripps Research
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att applicera ett enda monolager av grafen på elektronmikroskopirutnät och hur man förbereder dem för användning vid kryoEM-strukturbestämning.

Abstract

Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har visat sig vara en kraftfull teknik för att undersöka atomstrukturen hos makromolekylära komplex. Provberedning för kryoEM kräver att proverna bevaras i ett tunt lager glasaktig is, vanligtvis upphängd i hålen i en fenestrerad stödfilm. Alla vanliga provberedningsmetoder för kryoEM-studier exponerar dock provet för luft-vattengränssnittet, vilket introducerar en stark hydrofob effekt på provet som ofta resulterar i denaturering, aggregering och komplex dissociation. Vidare påverkar föredragna hydrofoba interaktioner mellan regioner i provet och luft-vattengränssnittet de orienteringar som makromolekylerna tar, vilket resulterar i 3D-rekonstruktioner med anisotrop riktningsupplösning.

Adsorption av kryoEM-prover till ett monolager av grafen har visat sig bidra till att mildra interaktioner med luft-vattengränssnittet samtidigt som införandet av bakgrundsbrus minimeras. Grafenbärare erbjuder också fördelen att avsevärt sänka den erforderliga koncentrationen av proteiner som krävs för kryoEM-avbildning. Trots fördelarna med dessa stöd används grafenbelagda rutnät inte i stor utsträckning av kryoEM-gemenskapen på grund av de oöverkomliga kostnaderna för kommersiella alternativ och de utmaningar som är förknippade med storskalig intern produktion. Denna artikel beskriver en effektiv metod för att förbereda batcher av kryoEM-rutnät som har nästan full täckning av monolagergrafen.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) är en alltmer tillämpbar teknik som används för att undersöka 3D-strukturer hos biomakromolekyler. Tekniska framsteg inom elektronmikroskopoptik, direkt elektrondetektion1 och datoralgoritmer 2,3,4 under det senaste decenniet har gjort det möjligt för kryoEM-användare att bestämma strukturerna hos biokemiskt stabila makromolekylära komplex till nära atomär upplösning 5,6,7,8 . Trots dessa framsteg finns det fortfarande anmärkningsvärda hinder för att bevara prover för kryoEM-avbildning, vilket hindrar majoriteten av biologiska prover från att lösas upp till så höga upplösningar.

Provberedning för högupplöst cryoEM-analys innebär att makromolekyler fångas in i ett brett spektrum av orienteringar i ett tunt lager av förglasad is. "Blot and plunge"-metoderna för frysning är de mest använda metoderna som används för att generera tunna filmer av biologiska prover på rutnät för kryoEM-studier 9,10. Dessa metoder innebär att man applicerar några mikroliter provlösning på ett EM-galler som innehåller en fenestrerad film som har gjorts hydrofil och därefter torkar bort större delen av provet med filterpapper innan gallret snabbt sänks ner i en kryogen av flytande etan eller etan-propanblandning9.

Även om denna metod framgångsrikt har använts för att bestämma strukturer för ett brett spektrum av biologiska prover, utsätter alla vanliga kryoEM-provberedningsmetoder prover för det hydrofoba luft-vattengränssnittet (AWI), vilket ofta introducerar problem som begränsar högupplöst strukturbestämning. Det är fastställt att biologiska prover har en hög benägenhet att denaturera när de utsätts för AWI, vilket kan leda till komplex aggregering och demontering11,12,13,14. Dessutom gör hydrofoba fläckar på ytan av biologiska prover att partiklar antar föredragna riktningar i isen12. I många scenarier tvingar en enda hydrofob region av provet alla partiklar att anta en singulär orientering i isen, vilket eliminerar förmågan att generera en tillförlitlig rekonstruktion. Förutom problem med AWI kan prover visa en affinitet för ytan på det fenestrerade filmskiktet, vilket begränsar antalet partiklar suspenderade i isen i hålen15.

Flera metodologiska och tekniska lösningar har utvecklats för att minska dessa problem som uppstår vid interaktioner med AWI eller filmerna16,17. En populär metod är att belägga den fenestrerade filmen i EM-gallren med ett tunt (tiotals nanometer) lager av amorft kol. Denna beläggning ger en kontinuerlig yta över hålen till vilken partiklar kan adsorbera, med fördelen att provet delvis skyddas från interaktioner med AWI15,18,19,20. Det extra kollagret ökar dock mängden bakgrundssignal i de avbildade områdena, vilket introducerar brus som kan äventyra uppnåelig upplösning, särskilt för små (<150 kDa) prover. Under de senaste åren har användningen av grafenoxidflingor (GO) för att producera stödfilmer på kryoEM-rutnät visat sig ha fördelar jämfört med traditionellt amorft kol. GO-flingor produceras genom oxidation av grafitskikt, vilket resulterar i pseudokristallina skikt av monoskiktsgrafit som är hydrofila på grund av deras betydande syrehalt i form av karboxyl-, hydroxyl- och epoxigrupper på ytor och kanter. Kommersiella GO-flingor i vattenhaltiga suspensioner är billiga, och det finns många publicerade metoder för att applicera GO-flingor på EM-nät18,21. Dessa metoder resulterar dock ofta i rutnät som endast delvis är täckta med GO-flingor, samt regioner som innehåller flera lager av GO-flingor. Vidare bidrar GO-flingor med en märkbar bakgrundssignal till kryoEM-bilder som ligger nära den som observerats med tunt amorft kol22,23.

Orörd monolagergrafen, som består av en enda 2D-kristallin uppsättning kolatomer, skiljer sig från GO genom att den inte producerar faskontrast i elektronmikroskopet. Monolagergrafen kan därmed användas för att generera ett osynligt stödskikt för avbildning av biologiska prover. Monolayer-grafen är också starkare än GO och kan appliceras som ett enda monolager på ett EM-rutnät, och de senaste framstegen inom tillverkningen av grafenbelagda EM-rutnät har gjort det möjligt att förbereda högtäckande grafennät med ett lager internt 24,25,26,27,28,29,30. Men trots fördelarna med att använda grafenbelagda rutnät för kryoEM-strukturbestämning används de inte i stor utsträckning på grund av de oöverkomliga kostnaderna för kommersiella alternativ och komplexiteten i den interna produktionen. Här beskriver vi en steg-för-steg-guide för att effektivt producera EM-rutnät täckta med ett monolager av grafen för kryoEM-strukturbestämning av biologiska prover (figur 1). Genom att följa detta detaljerade protokoll kan cryoEM-forskare reproducerbart förbereda dussintals högkvalitativa grafenstödnät på en enda dag. Kvaliteten på de grafenbelagda gallren kan enkelt undersökas med hjälp av ett low-end transmissionselektronmikroskop (TEM) utrustat med ett LaB6-filament.

Protocol

1. Förberedelse av material och tillbehör som är nödvändiga för tillverkning av grafengaller

OBS: Grafen kontaminerar lätt, vilket minskar effektiviteten hos grafenbeläggningen och kvaliteten på grafengallren; Därför är det viktigt att noggrant rengöra alla material som kommer i kontakt med grafenet. Förberedelse av material och alla steg bör utföras i ett dragskåp.

  1. Samla ihop de nödvändiga materialen som kommer att användas för att belägga gallren med grafen (figur 2A).
  2. Skölj glaset flera gånger med avjoniserat (DI) vatten för att ta bort damm, ludd och oljiga rester.
  3. Använd engångsservetter för att rengöra täckglas med 75 % etanol och använd en luftdammare för att ta bort eventuella föroreningar.
    ANM.: Klämblocket för TEM-galler som används i detta protokoll kan rymma upp till 45 galler. För en stor batchproduktion av grafengaller kan 45 galler eller färre framställas samtidigt. Det rekommenderas dock att börja med en liten batchproduktion (fyra till sex rutnät) tills metoden är etablerad i labbet.

2. Beredning av 0,2 M ammoniumpersulfat (APS) i vatten

OBS: Denna APS-lösning används som ett etsmedel för att ta bort kopparstödet (Cu) från grafen/Cu-arket i ett senare steg. Förbered alltid en ny APS-lösning. Återanvända eller gamla lösningar etsar inte koppar effektivt och kan lämna kopparrester på grafenet i de senare stegen.

  1. Skölj en 500 ml kolv med avjoniserat vatten (DI), tillsätt sedan 200 ml DI-vatten och mikrovågsugn med maximala inställningar i cirka 1 minut för att avgasa vattnet.
  2. Tillsätt 9 g ammoniumpersulfat till 200 ml DI-vatten för att producera en lösning av 0,2 M APS.
    VARNING: APS är giftigt, det rekommenderas att bära personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av APS. Kassera APS-avfall i en godkänd avfallshanteringsanläggning.
  3. Rör om lösningen med en omrörningsstång på en magnetomrörare samtidigt som du ansluter kolven till en vakuumkälla under ett dragskåp.
    OBS: Avgasning av APS-lösning hjälper till att förhindra bildandet av bubblor, vilket kan minska effektiviteten av Cu-etsning i steg 6.

3. Överför grafen/koppar till ett rent täckglas med en bit läskpapper

OBS: Vi använder en 15 x 15 cm kemisk ångavsättning (CVD) grafenfilm på Cu från en grafenleverantör. Kommersiellt inköpta monolayer grafen/Cu-ark bör förvaras under vakuum. Eftersom grafen odlas på båda sidor av Cu med CVD-metoden, utför grafenleverantörer i allmänhet kvalitetskontroller och rekommenderar den bättre sidan för användning. Vi hänvisar till denna rekommenderade sida av grafen som den "övre" sidan medan den andra sidan är den "bakre" sidan i detta protokoll.

  1. Klipp en bit läskpapper till en rektangulär form cirka 20 mm x 40 mm. Detta läskpapper används som vaddering för grafen/Cu-arket och kommer att absorbera överskott av metylmetakrylat (MMA (8.5) MMA EL6) som används för att belägga grafen/Cu-arket; Se därför till att skära den i en storlek som är större än grafen/Cu-arket som ska användas.
  2. Använd polyimidtejp för att tejpa fast läskpapprets fyra hörn på toppen av ett rent täckglas som passar in i en hemmagjord centrifugering.
    OBS: Polyimidtejp används eftersom den är tunn och lätt kan tas bort, vilket gör hanteringen enkel.
  3. Ta bort en bit av grafen/Cu-arket från vakuumlagret.
  4. Använd en ren och dammfri sax för att försiktigt klippa en liten fyrkant av Cu-grafenarket som räcker för att helt täcka antalet rutnät som ska förberedas. För 25 rutnät arrangerade i en 5 x 5 matris, till exempel, skär en bit som är 18 mm x 18 mm. Placera grafen/Cu-arket ovanpå läskpappret med en ren, torr pincett. Se till att baksidan av grafen/Cu-arket är vänd nedåt och var försiktig så att du inte av misstag vänder grafen/Cu-arket eftersom det är svårt att urskilja ovansidan från baksidan.
  5. Tejpa fast de fyra hörnen av grafen/Cu-arket på läskpapperet/täckglaset, vilket minimerar mängden kontakt mellan tejpen och grafen/Cu-arket, eftersom eventuella områden täckta med tejp inte kommer att täckas med MMA i nästa steg.
    OBS: Statisk urladdning kan skada grafenfilmer, och därför är det lämpligt att förbli elektriskt jordad och minimera ackumuleringen av statisk laddning vid hantering av grafen eller grafengaller. Detta kan åstadkommas genom att bära en jordningsrem på handleden eller röra vid ett jordat metallföremål omedelbart innan du hanterar grafen eller grafengaller.

4. Täck enskiktsgrafen/Cu-arket med ett tunt lager MMA(8.5)MMA EL6 (MMA)

OBS: Efter att Cu har etsats bort kommer detta lager av MMA att stödja grafenmonolagret för att möjliggöra hantering av grafenarket i framtida steg. MMA-beläggning möjliggör också visualisering av grafenfilmen eftersom ett monolager av enbart grafen skulle vara transparent.

  1. Placera täckglaset med det tejpade grafen/Cu-arket på en hemmagjord centrifugering (denna kan monteras med hjälp av en datorfläkt) inuti ett dragskåp (Figur 2B), som tidigare beskrivits av Han et al.25.
  2. Bär skyddsglasögon, tillsätt två droppar MMA med hjälp av en glaspipett på grafenarket och börja omedelbart snurra med maximal hastighet.
  3. Medan du snurrar, lägg till ytterligare två droppar i mitten. Centrifugera i 1 min.
    OBS: Se till att tillräckligt med MMA har applicerats för att helt belägga grafenet. Om du är osäker, tillsätt några fler droppar. Om grafen inte är helt belagt uppstår "hål" i filmen efter att Cu etsats bort.
  4. Låt lufttorka i 10 min i ett dragskåp.

5. Ta bort grafen på baksidan av grafen/Cu-arket

OBS: Grafen som odlas på baksidan av kopparn (den sida som inte är belagd med MMA) måste avlägsnas innan du går vidare till de efterföljande stegen eftersom detta överskott av grafen kommer att minska effektiviteten av Cu-etsning. Vi tar bort detta grafen genom att exponera grafenet för plasma, vilket kan åstadkommas med hjälp av vilken glödurladdningsanordning som helst som vanligtvis används för att förbereda EM-galler för biologisk provberedning.

  1. Ta försiktigt bort tejpen och lyft upp det MMA-belagda grafen/Cu-arket från täckglaset med en ren, torr pincett.
  2. Tejpa fast MMA/grafen/Cu-skivan med MMA-sidan nedåt på ett rent och dammfritt glastäcke.
  3. Placera täckglaset med MMA/grafen/Cu-arket i glödurladdningsanordningen och tillämpa inställningar som vanligtvis skulle användas när man förbereder galler för negativ fläck eller kryoEM sample beredning.
    OBS: Långvarig glödurladdning bör undvikas för att förhindra oxidation av Cu på baksidan, vilket kan resultera i kontaminering av kopparoxid (CuO) (nano)partiklar på grafenfilm.

6. Etsa bort Cu från MMA/grafen/Cu-arket i APS-lösning

  1. Häll 200 ml av den nygjorda APS-lösningen i en ren och dammfri kristalliseringsskål (150 x 75 mm) i ett dragskåp.
  2. Ta bort MMA/grafen/Cu-skivan från glasglaset. Håll koll på vilken sida som innehåller MMA.
  3. För att påbörja etsningen, placera MMA/grafen/Cu-arket med den plasmabehandlade Cu-sidan nedåt på ytan av APS-lösningen. Täck den breda glasbägaren med en bit aluminiumfolie eller ett lock för att förhindra att damm tränger in.
  4. Inkubera i 3 timmar. Om det mesta av Cu inte är etsat efter 1 timme, upprepa stegen i avsnitt 2-6 och fortsätt sedan till nästa steg.
    OBS: Om det mesta av Cu inte är etsat efter 1 h, är det troligt att MMA/grafensidan av filmen har placerats ner på ytan av APS-lösningen istället för Cu-sidan. Cu ska etsas helt efter 3 timmar, och MMA/grafenfilmen är färglös om Cu etsas helt. Grafen förorenar lätt, så se till att täcka alla behållare för att undvika ansamling av ludd eller feta rester på ytorna, eftersom detta kommer att påverka grafenets kvalitet negativt.

7. Skölj MMA/grafenfilmen i DI-vatten

  1. Fyll en ren och dammfri kristalliseringsskål med DI-vatten i ett dragskåp.
  2. Skopa försiktigt upp grafen-MMA-filmen med ett rent, dammfritt glastäcke placerat i ~45° vinkel i förhållande till APS-lösningens yta.
  3. Placera glasrutschkanan i nästan 90° vinkel mot vattnet och sänk försiktigt ner glasskyddet i vattnet så att MMA/grafenet långsamt glider av rutschkanan och flyter på vattenytan.
  4. Låt MMA/grafenfilmen ligga kvar på vattenytan i 1 timme för att tvätta bort eventuell APS.

8. Rengör gallren som ska beläggas med ett monolager grafen

OBS: Rutnäten som grafenet ska överföras till måste vara så rena som möjligt för att maximera grafenets fastsättning på gallerfoliens yta. Kommersiellt inköpta galler innehåller ofta kvarvarande föroreningar som måste avlägsnas före grafenöverföring.

  1. Rengör och torka tre kristalliserande skålar så att de är fria från damm.
  2. Häll 200 ml kloroform, aceton och isopropylalkohol (IPA) i var och en av de tre kristalliserande skålarna i ett dragskåp. Täck de kristalliserande skålarna med aluminiumfolie för att minimera avdunstningen av de organiska lösningsmedlen.
    VARNING: Kloroform och aceton orsakar hudirritation och kan vara giftiga vid inandning. Begränsa exponeringen för dessa organiska lösningsmedel och använd personlig skyddsutrustning.
  3. Placera basen på clamping TEM gallerhållarblock i botten av den första kristalliseringsskålen som innehåller 200 ml kloroform.
  4. Överför varje galler individuellt från gallerlådan till en brunn i gallerhållarblocket, se till att den fenestrerade filmsidan är vänd uppåt. Täck den kristalliserande skålen med aluminiumfolie, placera den på en orbitalshaker och skaka försiktigt i 30 minuter.
  5. Placera metalllocket på gallerhållarblocket, som kommer att säkra gallren under överföringen till nästa kristalliseringsskål. Lyft försiktigt ut gallerhållarblocket ur kristalliseringsskålen med en böjd gaffel och en lång pincett och placera det i botten av den andra kristalliseringsskålen som innehåller 200 ml aceton. Ta bort locket från gallerhållarblocket och skaka försiktigt på en orbital shaker i 30 minuter.
  6. Sätt på locket på gallerhållarblocket och överför till en kristalliseringsskål som innehåller 200 ml IPA-lösning för att rensa bort acetonrester. Ta bort locket från gallerhållarblocket och skaka försiktigt i 20 minuter.
  7. Överför gallren individuellt med den fenestrerade filmsidan uppåt från gallerhållarblocket till en petriskål av glas täckt med läskpapper.
  8. Torka gallren i minst 30 minuter under dragskåpet och se till att gallren är täckta för att förhindra att damm landar på det.

9. Överför de rena gallren till läskpapper som placerats på ett trådnät av rostfritt stål eller perforerad bricka under DI-vatten

OBS: Galler måste sänkas ner under DI-vatten på en plan yta så att grafenet kan flyta på vattnet och sänkas ner på gallren. Detta kan utföras med hjälp av ett kommersiellt gallerbeläggningstråg eller med en petriskål och en peristaltisk pump, som används för att generera grafenoxidgaller, som beskrivs av Palovcak et al.18.

  1. Placera nätet eller brickan i rostfritt stål i ett gallerbeläggningstråg och skölj med DI-vatten.
  2. Klipp läskpappret som är något mindre än nätet/brickan i rostfritt stål och placera det ovanpå plattformen, nedsänkt i DI-vattnet.
    OBS: Läskpapperet är något mindre än plattformen för att möjliggöra förflyttning och hantering.
  3. Överför försiktigt de rengjorda gallren med den fenestrerade filmsidan uppåt ovanpå läskpapperet. Gallren kommer sannolikt att vara hydrofoba, så sänk ner gallren i vattnet vertikalt, annars kan de böjas på grund av vattenspänning. Placera rutnäten i en kvadratisk matris så att de är så nära varandra som möjligt, men inte överlappar varandra (Figur 2C).
  4. Gallren är nu redo att beläggas med ett grafenmonolager. Fyll gallerbeläggningstråget med mer DI-vatten så att vattenytan är minst 5 mm ovanför gallren.

10. Överför grafen till rutnäten

  1. Gröp försiktigt ut MMA/grafenfilmen från kristalliseringsskålen med en ren täckglas genom att långsamt sänka ner täckglaset i tråget i en vinkel, en bit bort från grafenfilmen. Placera täckglaset under grafen-MMA-arket så att kanterna på täckglaset och täckglaset är parallella, och lyft sedan täckglaset vertikalt ur vattnet och ta med MMA/grafenfilmen.
  2. Överför MMA/grafenfilmen till tråget genom att sänka ner täckglaset i vattnet i en ~45° vinkel, så att MMA/grafenfilmen lossnar från täckglaset och flyter på vattenytan.
  3. Placera MMA/grafenfilmen direkt ovanför gallren innan vattennivån sänks. Använd en Pasteur-pipett av glas vars spets har smälts för att täta öppningen för att försiktigt manipulera positionen för MMA/grafenfilmen.
  4. Sänk långsamt vattennivån med sprutan, till cirka 1,25 ml/min så att MMA-/grafenfilmen helt täcker gallerytorna när den landar på filterpapperet
    OBS: Ytterligare manipulation av grafen-MMA-arket kan vara nödvändigt för att behålla sin position ovanför gallren när vattennivån sjunker.
  5. Använd en ren, torr pincett för att lyfta läskpappret som håller gallren till en ren, torr, dammfri petriskål, eller överför hela plattformen i rostfritt stål.
  6. Lufttorka MMA/grafengallren i minst 30 minuter under dragskåpet. Håll gallren täckta med aluminiumfolie eller lock för att förhindra kontaminering från dammpartiklar.
  7. Överför gallren till en inkubator och grädda gallren i en 65 °C inkubator i 30 min.
  8. Ta ut gallren ur inkubatorn och låt dem stå övertäckta i 5 minuter i rumstemperatur för att kyla gallren till rumstemperatur.

11. Ta bort MMA och rengöra gallren

OBS: MMA måste tvättas noggrant av i aceton för att förhindra kvarvarande MMA på de grafenbelagda gallren.

  1. I ett dragskåp, förbered två kristalliseringsskålar som innehåller 200 ml aceton och en kristalliseringsskål som innehåller 200 ml isopropanol (IPA) vid rumstemperatur. Täck de kristalliserande skålarna med aluminiumfolie för att minimera avdunstningen av de organiska lösningsmedlen.
    VARNING: Använd personlig skyddsutrustning när du hanterar aceton eftersom det kan orsaka hudirritation och kan vara skadligt vid inandning.
  2. Placera basen på klämblocket TEM-gallerhållare i botten av den första kristalliseringsskålen som innehåller 200 ml färsk aceton.
  3. Överför varje rutnät individuellt från läskpappret till ett fack i gallerhållarblocket, se till att MMA-sidan är vänd uppåt. Täck den kristalliserande skålen med folie, placera den på en orbital shaker och skaka försiktigt i 30 minuter.
  4. Placera metalllocket på gallerhållarblocket, som kommer att säkra gallren under överföringen till nästa kristalliseringsskål. Lyft försiktigt ut gallerhållarblocket ur kristalliseringsskålen med en böjd gaffel och en lång pincett och placera det i botten av den andra kristalliseringsskålen som innehåller 200 ml färsk aceton. Ta bort locket från gallerhållarblocket och skaka försiktigt på en orbital shaker i 30 minuter.
  5. Sätt på locket på gallerhållarblocket och överför till kristalliseringsskålen som innehåller 200 ml IPA-lösning för att rensa bort acetonrester. Ta bort locket från gallerhållarblocket och skaka försiktigt i 20 minuter.
  6. Lägg gallren i en liten petriskål av glas täckt med läskpapper och lufttorka gallren i minst 10 minuter. Håll gallren täckta med ett lock för att förhindra kontaminering från dammpartiklar.
  7. Galler är redo att användas eller överföras till en gallerlåda insvept med aluminiumfolie inuti en vakuumexsickator.
    OBS: Förvaring av grafengaller i en vakuumexsickator kan förhindra kontaminering av hydrofoba partiklar från omgivningsförhållanden. Dessa galler kan lagras i upp till flera månader innan de används27.

12. Gör grafengaller hydrofila med UV/ozonbehandling

OBS: Grafen är extremt hydrofobt, vilket inte är kompatibelt med kryoEM-provberedning, eftersom blot-plunge-metoder kräver en hydrofil yta på vilken en droppe prov kan spridas jämnt. Medan traditionella glödurladdningsanordningar kan konfigureras för att försiktigt pulsera plasma för att göra grafenytan hydrofil, tenderar dessa enheter att förstöra det tunna grafenmonolagret. Det har tidigare visats att en UV/ozonrenare kan användas för att delvis syresätta ytan på grafen25, vilket gör den hydrofil för kryoEM-provberedning utan att skada monolagret.

  1. Om du använder ett UV/ozonsystem som kräver priming, slå på systemet och fyll lamp i 10 minuter (i detta steg, se till att inga galler är exponerade). Medan UV/ozonrengöraren grundas, ta bort gallren från vakuumexsickatorn och överför dem till ett rent täckglas.
  2. När UV/Ozonsystemet är klart, placera täckglaset som innehåller gallren med grafensidan uppåt i UV/ozonrenaren och utsätt gallren för ozongasen i 4 minuter.
  3. Efter exponering för ozon, använd gallren omedelbart för kryoEM-provberedning.
    OBS: Om du använder ett UV/ozonsystem som kräver priming, måste galler placeras i dammsugaren omedelbart efter att lamp har grundats i 10 minuter, annars blir det för svalt för att producera tillräckligt med ozongas för att syresätta grafenet för sample beredning. Utsätt inte gallren för ozongasen i mer än 6 minuter, eftersom det förstör grafenskiktet.

Representative Results

Framgångsrik exekvering av grafennätstillverkningsprotokollet som beskrivs här kommer att resultera i EM-rutnät som är helt belagda med ett enda monolager grafen. Rutnätens grafentäckning kan kontrolleras med hjälp av vilket TEM som helst. Eftersom ett monolager av rent grafen är nästan osynligt i TEM, måste man undersöka det med hjälp av mikroskopets diffraktionsläge och observera Bragg-fläckar som motsvarar den hexagonala organisationen av kolatomerna som utgör grafenet (Figur 3A). Det är normalt att ibland observera vissa rynkor av monoskiktgrafen, som introduceras under MMA-beläggning (Figur 3B). Man kan också kontrollera föroreningsnivån på grafenet genom att få en högförstoringsbild i mitten av ett av de grafentäckta hålen (Figur 3C). Om en Fouriertransform av denna bild tas med en högupplöst detektor bör den innehålla Bragg-fläckar som motsvarar kol-kol-avståndet vid 2,14 Å (figur 4C). Ett monolager av kolatomer producerar inte tillräckligt med elektronspridning för att generera faskontrast, och därför kommer en bild av ren grafen inte att presentera Thon-ringar associerade med kontrastöverföringsfunktionen i en Fouriertransform av bilden. Det är dock mycket svårt att förhindra kontaminering av grafengaller efter att de har producerats, och otillräcklig tvättning av EM-gallren eller avlägsnande av MMA efter grafenbeläggning kommer att resultera i anmärkningsvärda föroreningar på gallren som är synliga i bilderna från rymden (figur 3C). Som visas i figur 4 har grafengaller en koncentrerande effekt på ett prov, vilket observeras vid jämförelse av 0,5 mg/ml apoferritin appliceras på håliga guldgaller med (figur 4A) och utan grafenbärare (figur 4B). Liknande grafentillverkningsprotokoll har tidigare beskrivits för att lösa kryoEM-strukturer av proteiner såsom apoferritin med hög upplösning25,27.

Figure 1
Figur 1: Schematisk för beredning av grafenbelagda kryoEM-rutnät. Viktiga steg i processen för tillverkning av grafennät illustreras. Förkortningar: cryoEM = kryogen elektronmikroskopi; MMA = metylmetakrylat; APS = ammoniumpersulfat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Material som krävs för att tillverka grafengaller . (A) Nödvändiga material för beläggning av kryo-EM-galler är märkta i enlighet med detta. (B) Närbild av bestrykaren med grafen/Cu-ark fasttejpat på ett läskpapper på ett glasglas. Centrifugeringen kan monteras genom att köpa delar från en lokal dator-/järnaffär. C) Närbild av gallerbeläggningstråget fäst vid en spruta som kan användas för att kontrollera vattennivån. Rutnät placeras ovanpå ett läskpapper på ett nät av rostfritt stål. Läskpapperet hjälper till att manövrera placeringen av rutnäten så att grafenarket kan matchas med det. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: En representativ bild av diffraktionsmönstret och ljusfältsbilder av ett grafenrutnät som visar rynkor eller MMA-kontamination . (A) EM-rutnät täckta med ett monolager av grafen kommer att visa Bragg-toppar som motsvarar grafenets sexkantiga gitter när de avbildas i ett TEM i diffraktionsläge. Bragg-toppen, som motsvarar 2,14 Å kol-kol-avståndet, är inringad och betecknad med en pil. (B) En ljusfältsbild av ett grafenrutnät med ett enda lager med några rynkor (markerade med en pil) i grafenmonolagret. (C) En ljusfältsbild av monolagergrafen med MMA-kontamination (betecknad med en pil). Skalstreck = 100 nm (B,C). Förkortningar: EM = elektronmikroskopi; MMA = metylmetakrylat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Apoferritin på grafentäckta guldgaller: (A) CryoEM-mikrobild av 0,5 mg/ml apoferritin på grafentäckta guldgaller. (B) Apoferritin avbildat i samma koncentration är synligt vid betydligt lägre koncentration när det bereds med hjälp av håliga guldrutnät utan grafen. (C) FFT för kryoEM-mikrografen på 0,5 mg/ml apoferritin på grafentäckta guldrutnät, med Bragg-topparna som motsvarar det hexagonala grafengittret betecknat. Skalstreck = 100 nm (A,B). Förkortningar: cryoEM = kryogen elektronmikroskopi; FFT = snabb Fouriertransform. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Bevarandet av biologiska prover i ett tunt lager av glasaktig is är ett kritiskt viktigt steg för högupplöst bestämning av kryoEM-strukturen. Forskare stöter dock ofta på problem som uppstår på grund av interaktioner med AWI, som introducerar föredragen orientering, komplex demontering, denaturering och aggregering. Dessutom kan proverna inte alltid koncentreras tillräckligt för att befolka den tunna isen som är upphängd över hålen i en fenestrerad film. Flera forskargrupper har utvecklat metoder för att belägga EM-rutnät med ett monolager av grafen för att hjälpa till att övervinna några av dessa begränsningar 24,25,26,27,28,29,30, och grafennät har använts med stor framgång. Här ger vi steg-för-steg-instruktioner för att effektivt förbereda partier av grafengaller internt och undersöka kvaliteten på grafengallren med TEM. Vi betonar att särskild försiktighet bör iakttas under några av de kritiska stegen, som vi beskriver nedan.

Grafen har en stark tendens att dra till sig luftburna föroreningar. Därför är det viktigt att se till att alla verktyg som kommer i kontakt med grafen/Cu-arket eller gallren är rena och dammfria under tillverkningsprocessen för grafengaller. Täckglas som används för att överföra grafen kan rengöras genom att skölja med etanol och DI-vatten eller använda en luftdammare. Det rekommenderas också att arbeta under ett dragskåp och alltid hålla grafenark och galler täckta med folie eller en ren glasplatta. Damm eller föroreningar på gallren kan hindra grafen från att fästa ordentligt på EM-gallren. Vid hantering av grafen eller grafenbelagda bärverk är det viktigt att vara elektriskt jordad för att förhindra skador på grafenfilmen på grund av statisk urladdning. Statisk urladdning kan undvikas genom att använda en jordningsrem för handleden, vidröra ett jordat metallföremål varje gång grafen eller grafengaller hanteras och/eller inte bära en handske på handen som håller pincetten24.

Eftersom ett monolager av grafen är mycket tunt (bredden på en kolatom) är det viktigt att stödja grafen med ett organiskt skikt som MMA eller poly-MMA (PMMA) under överföringen av grafen till rutnät. PMMA är det mest använda materialet för grafenöverföring. PMMA har dock en stark affinitet med grafen och kan ofta resultera i polymerkontaminering på grafenfilmen. MMA används i detta protokoll, eftersom det lämnar mindre kvarvarande kontaminering25. Både PMMA och MMA har dock nackdelen att de bildar rynkor och sprickor som kan observeras i vissa delar av grafenfilmen (Figur 3B). Det kan vara svårt att undvika dessa rynkor eftersom de ofta uppstår under grafentillväxt med CVD-metoden31. En metod har nyligen utvecklats för att odla ultraplatt grafen utan rynkor, där kopparfolien ersätts med en Cu(111)/safirskiva som tillväxtsubstrat32.

Baserat på vår erfarenhet är det bättre att köpa grafen/Cu-skivor och stödja grafenet med MMA internt än att köpa polymerbelagda Cu-grafenskivor från tillverkare, som blir spröda efter kopparetsning och är svåra att hantera i efterföljande steg. Spinncoatern vi använde för MMA-beläggning kan byggas billigt med hjälp av delar från en lokal dator/järnaffär, som tidigare beskrivits25.

Under steget med MMA-beläggning är det viktigt att täcka hela grafenytan på Cu-grafenarket med MMA. Efter att Cu har etsats bort kommer MMA-grafen att bli halvgenomskinligt, och områden som saknar MMA-täckning kommer att se ut som tomma hål. För att förhindra MMA-beläggning på kopparsidan är det viktigt att placera en liten bit läskpapper under den under beläggningen så att den suger upp överflödig MMA som spinner ut från CVD-filmen.

Efter etsning och sköljning är MMA/grafenarket redo att överföras till EM-galler med hjälp av ett kommersiellt eller hemmagjort trågsystem med en spruta eller peristaltisk pump för att kontrollera vattennivån. Före överföringssteget är det viktigt att noggrant förskölja gallren i successiva bad av kloroform, aceton och IPA. Bakning av grafenbelagda galler vid 65 °C hjälper till att bevara grafenintegriteten och främjar adsorptionen av grafen till gallren. Slutligen, för att förhindra MMA-kontaminering på gallren, är det viktigt att noggrant ta bort MMA i ett acetonbad och rengöra gallren i IPA. Eventuella otvättade MMA-rester kommer att observeras på EM-galler och minska signal-brusförhållandet i bilderna (Figur 3C). Aceton-IPA-tvättprocessen kan upprepas för att ytterligare rengöra grafenytorna.

För att göra grafengallren hydrofila exponerade vi gallren för UV/ozon. Olika modeller av UV/ozonrenare kan kräva optimering för att tillräckligt syresätta grafenskiktet för kryoEM-provberedning utan att skada grafenet. Oavsett system är det viktigt att använda dessa galler för applicering av kryoEM-prover omedelbart efter UV/ozonbehandling. Alternativa metoder för att göra grafenrutnät hydrofila beskrivs i andra studier33,34.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Xiao för hjälpsamma diskussioner när vi etablerade dessa metoder på Scripps Research. B.B. fick stöd av ett postdoktoralt forskningsstipendium från Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. stöds av ett predoktoralt stipendium från National Science Foundation. D.E.P stöds av National Institutes of Health (NIH) anslag NS095892 till G.C.L. Detta projekt stöddes också av NIH-anslag GM142196, GM143805 och S10OD032467 till G.C.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
  30. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).

Tags

Tillverkning grafenbelagda rutnät i ett lager kryoelektronmikroskopi provberedning glasaktig is fenestrerad stödfilm hydrofob effekt denaturering aggregering komplex dissociation hydrofoba interaktioner 3D-rekonstruktioner anisotrop riktningsupplösning grafenstöd bakgrundsbrus proteinkoncentration kryoEM-avbildning kostnad storskalig produktion
Tillverkning av grafenbelagda nät i monolager för kryoelektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., … More

Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter