בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic
Abstract
Metagenomic ספריות ארכיון שברים גדולים של רצפי הגנום של מיקרואורגניזמים רציף ללא צורך טיפוח מוקדמת. יצירת הליך יעיל ליצירה ההקרנה ספריות metagenomic ולכן הוא שימושי עבור תפוקה גבוהה חקירות יעיל לתוך המאפיינים גנטית מטבולית של חיידקים מכלולים שאין להם תרבות. הנה, פרוטוקולים מפתח מוצגים על וידאו, אשר אנו מציעים הוא פורמט שימושי ביותר עבור במדויק לתיאור תהליך ארוך לסירוגין תלוי מכשור רובוטיים (אדם) התערבות ידנית. ראשית, אנו מועסקים רובוטיקה לזהות שיבוטים ספריה על צפיפות גבוהה ממברנות macroarray, שכל אחד מהם יכול להכיל מושבות לשכפל 20-4 צלחות ספריה-384 גם כן. אוטומציה הוא חיוני עבור הליך זה לא רק דיוק ומהירות, אלא גם בשל המזעור של סולם הנדרשים כדי להתאים את מספר גדול של שיבוטים ספריה לתוך סידורים מרחביים צפוף מאוד. לאחר שנוצר, אנחנו הבא הדגימו איך ממברנות macroarray ניתן לגילוי גנים של עניין באמצעות גרסאות של פרוטוקולים סטנדרטיים עבור תיוג בדיקה, הכלאה קרום, זיהוי האות. אנו משלימים את ההפגנה החזותי של נהלים אלה עם תיאורים מפורטים בכתב של השלבים הכרוכים ואת החומרים הדרושים, אשר כולם זמינים באופן מקוון לצד הווידאו.
Protocol
Discussion
נוהל הפשטת לא עבר אופטימיזציה. עם זאת, הליך הפשטה ניתנה הוראה של היצרן (2 רוחץ כל 10 דק 'ב 100% אתנול, לשטוף 1 של ח 1 ב 60 ° C ב 0.5% SDS) אינה מספקת. לפחות הדגירה לילה אתנול 100% יש צורך לפרק את המוצר התגובה ECF; הדגירה מספר ימים אתנול 100% נראה כי אין השפעות שליליות על היכולת reprobe הממברנה. SDS של יצרנ…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
