Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche
Abstract
Metagenomica frammenti di archiviare librerie di grandi dimensioni contigue sequenze genomiche da microrganismi senza la necessità di coltivazione precedente. Generazione di una procedura semplificata per la creazione e lo screening librerie metagenomiche è quindi utile per una efficiente high-throughput indagini sulle proprietà genetiche e metaboliche di assemblaggi microbica incolti. Qui, i protocolli chiave sono presentati in video, che vi proponiamo è il formato più utile per descrivere con precisione un lungo processo che dipende alternativamente sulla strumentazione robotica e (umano) interventi manuali. In primo luogo, abbiamo impiegato robotica di individuare cloni biblioteca su membrane ad alta densità macroarray, ognuno dei quali può contenere colonie duplicati da ventiquattro tavole biblioteca da 384 pozzetti. L'automazione è fondamentale per questa procedura non solo per precisione e velocità, ma anche per la miniaturizzazione di scala necessarie per montare il gran numero di cloni biblioteca accordi spaziali ad alta densità. Una volta generato, siamo prossimi dimostrato come le membrane macroarray possono essere sottoposti a screening per geni di interesse utilizzando versioni modificate di protocolli standard per l'etichettatura della sonda, l'ibridazione della membrana, e la rilevazione del segnale. Abbiamo completato la dimostrazione visiva di queste procedure, con dettagliate descrizioni scritte delle fasi coinvolte ed i materiali necessari, che sono tutti disponibili online a fianco del video.
Protocol
Discussion
La procedura di stripping non è stato ottimizzato. Tuttavia, la procedura di stripping dato nelle istruzioni del produttore (2 lavaggi ciascuno, 10 minuti in 100% di etanolo, 1 lavaggio di 1 ora a 60 ° C a 0,5% SDS) è insufficiente. Almeno notte di incubazione in etanolo al 100% è necessario per sciogliere il prodotto di reazione ECF; diversi giorni di incubazione in 100% di etanolo non sembra avere effetti negativi sulla capacità di reprobe la membrana. Trattamento SDS del produttore sembra essere insufficiente. NUF ha provato 1 ora a…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
