Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken
Abstract
Metagenomic bibliotheken archief grote fragmenten van aaneengesloten genomische sequenties van micro-organismen zonder voorafgaande teelt. Het genereren van een gestroomlijnde procedure voor het maken en screening metagenomic bibliotheken is dus nuttig voor een efficiënte high-throughput onderzoek naar de genetische en metabolische eigenschappen van onbeschaafde microbiële assemblages. Hier zijn de belangrijkste protocollen gepresenteerd op video, die we voorstellen is de meest bruikbare indeling voor het nauwkeurig beschrijven van een lang proces dat afwisselend afhankelijk van de robotica instrumentatie en (menselijke) handmatige interventies. Eerst hebben we in dienst robotica in de bibliotheek van klonen op high-density macroarray membranen, die elk kunnen dupliceren kolonies bevatten twintig-vier 384-wells platen bibliotheek plaats. Automatisering is van essentieel belang voor deze procedure niet alleen voor de nauwkeurigheid en snelheid, maar ook als gevolg van de miniaturisering van voldoende omvang om het grote aantal van de bibliotheek klonen passen in zeer dichte ruimtelijke arrangementen. Eenmaal gegenereerd, hebben we naast gedemonstreerd hoe de macroarray membranen kunnen worden gescreend op genen van belang met behulp van aangepaste versies van standaard protocollen voor probe etikettering, membraan hybridisatie, en signaal detectie. We aanvulling op de visuele demonstratie van deze procedures met gedetailleerde beschrijvingen van de betrokken stappen en de benodigde materialen, die allemaal zijn online beschikbaar naast de video.
Protocol
Discussion
De strippen procedure is nog niet geoptimaliseerd. Echter, de strippen procedure in opdracht van de fabrikant (2 wasbeurten per stuk, 10 min in 100% ethanol, een wash van 1 uur bij 60 ° C in 0,5% SDS) is onvoldoende. In ieder geval overnacht incubatie in 100% ethanol nodig is om de ECF reactieproduct te ontbinden; enkele dagen incubatie in 100% ethanol lijkt te hebben geen nadelige effecten op het vermogen om het membraan reprobe. De door de fabrikant SDS behandeling lijkt ook onvoldoende. Nuf heeft geprobeerd een uur bij 80 ° C met 0,5% …
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
