Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

High Throughput Screening Vurdering av reaktive oksygenarter (ROS) generasjon ved bruk av Dihydroethidium (DHE) fluorescens fargestoff

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66238
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

Summary

Denne protokollen beskriver en ny metode for å kvantifisere intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved bruk av dihydroethidium (DHE) som en fluorescensfargestoffsonde ved hjelp av en screening-tilnærming med høy gjennomstrømning. Protokollen beskriver metodene for kvantitativ vurdering av intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) i de tre forskjellige hepatocellulære karsinomcellelinjene.

Abstract

Reaktive oksygenarter (ROS) spiller en nøkkelrolle i reguleringen av cellulær metabolisme i fysiologiske og patologiske prosesser. Fysiologisk ROS-produksjon spiller en sentral rolle i romlig og tidsmessig modulering av normale cellulære funksjoner som spredning, signalering, apoptose og aldring. I motsetning til dette er kronisk ROS-overproduksjon ansvarlig for et bredt spekter av sykdommer, som blant annet kreft, kardiovaskulær sykdom og diabetes. Kvantifisering av ROS-nivåer på en nøyaktig og reproduserbar måte er derfor avgjørende for å forstå normal cellulær funksjonalitet. Fluorescensavbildningsbaserte metoder for å karakterisere intracellulære ROS-arter er en vanlig tilnærming. Mange av bildebehandlings-ROS-protokollene i litteraturen bruker 2'-7'-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) fargestoff. Imidlertid lider dette fargestoffet av betydelige begrensninger i bruk og tolkbarhet. Den nåværende protokollen demonstrerer bruken av en dihydroethidium (DHE) fluorescerende sonde som en alternativ metode for å kvantifisere total ROS-produksjon i en høy gjennomstrømningsinnstilling. Bildeplattformen CX7 Cellomics ble brukt til å måle og kvantifisere ROS-produksjonen. Denne studien ble utført i tre hepatocellulære kreftcellelinjer - HepG2, JHH4 og HUH-7. Denne protokollen gir en grundig beskrivelse av de ulike prosedyrene som er involvert i vurderingen av ROS i cellene, inkludert - fremstilling av DHE-løsning, inkubasjon av celler med DHE-løsning og måling av DHE-intensitet som er nødvendig for å karakterisere ROS-produksjonen. Denne protokollen demonstrerer at DHE fluorescerende fargestoff er et robust og reproduserbart valg for å karakterisere intracellulær ROS-produksjon på en høy gjennomstrømningsmåte. Tilnærminger med høy gjennomstrømning for å måle ROS-produksjon vil sannsynligvis være nyttige i en rekke studier, for eksempel toksikologi, legemiddelscreening og kreftbiologi.

Introduction

Reaktive oksygenarter (ROS) er en gruppe naturlig forekommende, svært reaktive og temporalt ustabile kjemiske radikaler dannet som en del av den normale cellulære metabolismen i celler. ROS spiller en viktig og viktig rolle i moduleringen av normale fysiologiske og biokjemiske prosesser som forekommer i celler 1,2. Hovedkilden til ROS-produksjon i celler er fra mitokondriell elektrontransportkjede (ETC) -banen som en del av den normale bioenergetiske syklusen. Signifikante tilleggskilder til ROS-produksjon inkluderer enzymatiske reaksjoner som cellulære NADPH-oksidaser i celler. Metabolisme av matmolekyler (f.eks. glukose) skjer via den oksidative fosforyleringsveien i mitokondriematrisen. Et basisnivå av ROS-produksjon er avgjørende for å regulere normale fysiologiske cellesignaleringsprosesser. Mange viktige proteinmolekyler som er en del av glukosemetabolske signalveier (f.eks. Akt og PTEN) er kjent for å reagere på intracellulære ROS-nivåer. I tillegg produseres ROS av forskjellige intracellulære enzymer som xantinoksidase, nitrogenoksidsyntase og peroksisomale bestanddeler som en del av de cellulære enzymatiske veiene 1,2. I motsetning til de naturlige kildene til ROS, fører visse miljøfaktorer, som xenobiotika, smittsomme stoffer, UV-lys, forurensning, sigarettrøyking og stråling, også til overdreven produksjon av ROS, som er en nøkkeldriver for intracellulært oksidativt stress 1,3. Forhøyet cellulært oksidativt stress kan forårsake skade på innfødte biomolekyler inne i en celle, som lipider, proteiner og DNA, forårsaker forskjellige sykdommer som kreft, diabetes, kardiovaskulær sykdom, kronisk betennelse og nevrodegenerative lidelser 1,3,4. Derfor er nøyaktige målinger av ROS avgjørende for å forstå de cellulære mekanismene som er involvert i oksidativ stressindusert sykdomspatofysiologi.

På grunn av de korte tidsskalaene for ROS-produksjon og eliminering inne i celler, er kvantitative målinger av forskjellige ROS-radikaler fortsatt en utfordring. Metoder som elektronparamagnetisk resonans (EPR)5, høytrykksvæskekromatografi (HPLC) og fluorescensprobebasert avbildning brukes til å måle de forskjellige cellulære ROS6. Mens metoder som EPR og HPLC gir kvantitativt nøyaktige estimater, involverer disse metodene ødeleggelsen av den cellulære romlige morfologien og er vanligvis i form av globale og bulkmålinger av en prøve. I motsetning til dette beholder bildebaserte metoder som fluorescensprobebaserte metoder den cellulære morfologien og romlige konteksten til ROS-generasjonen. Imidlertid har spesifisiteten til forskjellige fluorescensprober for forskjellige typer ROS-radikaler ikke blitt godt etablert 7,8. Flere fluorescerende prober som dihydroethidium (DHE), diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), dihydrorhodamin (DHR), dimetylantracen (DMA), 2,7 diklordihydroflurescein (DCFH), 1,3-difenylisobenzofuran (DPBF) og MitoSox er tilgjengelige for ROS-deteksjon kommersielt. I de siste tiårene er DHE, MitoSox og DCFH-DA de vanlige fluorescerende fargestoffene for å måle ROS i celler og vev 8,9. DCFH-DA er et mye brukt fargestoff for å oppdage intracellulærH2O2og oksidativt stress. Til tross for populariteten til DCFH-DA, har flere tidligere studier vist at det ikke kan brukes pålitelig til å måle intracellulær H2O2 og andre ROS-nivåer 8,9,10,11,12,13,14.

I motsetning til dette viser fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) en spesifikk respons på det intracellulære superoksydradikalet (O2-). Mens superoksydradikalet er en av mange av ROS-artene som observeres i celler, er det et viktig radikal involvert i reduksjon av overgangsmetaller, omdannelse til peroksynitrat og dannelse av hydroperoksider, blant andre intracellulære effekter. DHE blir raskt tatt opp av cellene og har en fluorescensutslipp i det røde bølgelengdeområdet15. Ved reaksjon med superoksidradikal spesifikt danner DHE et rødt fluorescerende produkt, 2-hydroksyethidium (2-OH-E +). Dermed kan DHE betraktes som en spesifikk sonde for superoksiddeteksjon. Imidlertid kan DHE også gjennomgå uspesifikk oksidasjon med ONOO- eller OH.,H2O2og cytokrom c for å danne et andre fluorescensprodukt, ethidium E +, som kan forstyrre de målte 2-OH-E + -nivåene. Imidlertid representerer disse 2-OH E + og E + -produktene i kombinasjon en stor del av de totale cellulære ROS-artene som observeres inne i en celle når de er farget med DHE. E + interkalerer til DNA, og forbedrer fluorescensen 8,9,10,11,13,14,15,16. Siden fluorescensspektrene til ethidium og 2-hydroksyethidium bare er litt forskjellige, kan flertallet av ROS-nivåene sett i en celle sekundært til superoksidproduksjon detekteres og måles ved hjelp av DHE-fluorescensprodukter. Disse ROS-artene identifiseres ved hjelp av 480 nm bølgelengdeeksitasjon og 610 nm bølgelengdeutslipp 15,16,17.

I tillegg til å velge en spesifikk fluorescerende ROS-deteksjonssonde, er det viktig å velge en sensitiv deteksjonsmetode for å måle intracellulær ROS. Nøyaktig vurdering av intracellulære ROS-nivåer er derfor nøkkelen til å identifisere forstyrrede redoksbalansetilstander som forekommer i syke celler eller celler som har vært utsatt for ulike miljøstressorer som stråling, toksikologiske forbindelser og genotoksiske midler18. Siden ROS er et vanlig forekommende fenomen i celler som er ansvarlig for å regulere en rekke cellesignaleringsaktiviteter, er robuste metoder for deteksjon av ROS avgjørende. For å muliggjøre en slik høy gjennomstrømningsevaluering av ROS-produksjon i celler, bruker denne protokollen en HCS-plattform (High Content Screening) for å måle ROS-artene. Den nåværende protokollen tillater høy gjennomstrømningsanalyse av intracellulær ROS-produksjon, noe som er av kritisk betydning i mange toksikologiske studier19. Denne protokollen tar sikte på å gi en enkel og allsidig løsning for å oppdage og måle intracellulær ROS i adherente hepatocellulære karsinomceller. De kjemiske reagensene til H2O2 og menadion brukes som potente ROS-stimulatorer for å måle de relative nivåene av ROS-produksjon i en kontrollert og høy gjennomstrømningsinnstilling. Denne protokollen kan finjusteres for å måle ROS-produksjon i adherente og ikke-adherente celler under passende forhold, etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur

  1. Frø testcellene (HepG2, HUH7 og JHH4 hepatocellulære karsinomceller) til en 96-brønnsplate ved en såtetthet på 10.000 celler / brønn i et endelig såvolum på 200 μL per brønn.
    1. Før dyrking av HepG2-cellene, belegg de 96 platebrønnene med type IV kollagen (50 μg / ml) i 2 timers varighet ved romtemperatur (RT). For å unngå størkning av stamkollagenet, legg stamløsningen i is og start deretter fortynningsprosessen til ønsket konsentrasjon.
    2. Etter en 2 timers inkubasjonsperiode, aspirer av overflødig kollagen og vask brønnene tre ganger med 1x PBS.
  2. Dyrk cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) over natten ved 37 °C og 5 % CO2 -konsentrasjon i en fuktet inkubator.
  3. Neste dag, eller når du når 80% -90% konfluens, avhengig av hva som er først, behandle cellene med henholdsvis H2O2 (ubehandlet, 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM) og Menadione (ubehandlet, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), i 30 minutter for å indusere det representative oksidative stresset.
  4. Alternativt kan du velge å teste cellene med ønsket testsubstans som er i stand til å indusere oksidativt stress i cellene.

2. Lager og fortynnet løsningsforberedelse for DHE-farging av celler

  1. Klargjør DHE stamløsning (5 mg / ml eller 15,9 mM) ved å oppløse 5 mg DHE i 1 ml DMSO.
  2. Fortynn DHE-stamløsningen med dobbeltdestillert autoklavert vann til en endelig konsentrasjon på 100 μM.
  3. For å unngå fryse- og tineprosessen til fargestoffet (som kan skade fluorescensegenskapene over tid), klargjør flere alikoter i 1,5 ml sentrifugerør med en konsentrasjon på 100 μM og oppbevar dem ved -20 °C.
  4. For å oppnå en endelig arbeidskonsentrasjon på 10 μM, bruk en alikot med 100 μM DHE-konsentrasjon og fortynn den med forvarmede DMEM-medier.
    MERK: Arbeidsløsningen må tilberedes frisk på forsøksdagen.
  5. Vortex den fungerende fluorescensfargestoffløsningen i 5-10 s for å sikre riktig blanding av fargestoffet.

3. DHE fargeprosess

  1. Fjern mediet som inneholder stoffet eller teststoffet fra hver brønn og vask det forsiktig en gang med enten 1x PBS eller DMEM.
    MERK: Når du utfører addisjons- eller vasketrinnene i forsøket, er det avgjørende å unngå direkte kontakt mellom cellene og pipettoren. Dette kan oppnås ved forsiktig pipettering av PBS langs sidene av brønnene for å minimere potensiell mekanisk skade på cellene. Å sikre at pipettoren ikke berører cellene direkte, vil bidra til å opprettholde celleintegriteten og levedyktigheten i løpet av forsøket.
  2. Tilsett 100 μL DMEM-medier inneholdende 10 μM DHE (arbeidsløsning) i hver brønn og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
  3. Etter 30 min inkubasjonstid, fjern DHE-inneholdende medier og vask hver brønn forsiktig tre ganger med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Dette kan utføres med en flerkanalspittor for å sikre rask behandlingstid.
  4. Tilsett 200 μL 1x PBS til hver brønn med Hoechst 33342 kjernefysisk fargestoff i 10 minutter ved RT.
  5. Fjern Hoechst 33342 kjernefysisk fargeløsning fra brønnen og tilsett 200 μL 1x PBS til hver brønn.
    MERK: For å oppnå faste celler, følg samme protokoll som for levende celler, med ett ekstra trinn for å legge til 4% PFA i 5 minutter etter behandling og DHE-farging. Fjern PFA-oppløsningen og vask cellene med 1x PBS. Deretter inkuberer du cellene med kjernefysisk fargestoff i 10 minutter.
  6. Flytt platen over til screeningplattformen med høyt innhold, fluorescensmikroskopi eller plateleser for bildeopptak så raskt som mulig.

4. Bildeinnsamling og intensitetsmåling

  1. Plate lasting
    1. Åpne Cellomics CX7 high-content screening (HCS)-programvaren for datainnsamling.
    2. Kalibrer bildebehandlingsplattformen nøye i henhold til produsentens spesifikasjoner på forhånd med den spesifikke 96-brønnsplaten du velger for bruk for å unngå tåkete eller uskarpe bilder i dataene.
      MERK: Multibrønnsplater fra forskjellige leverandører kan ha forskjellige materialegenskaper og kan påvirke kvaliteten på de endelige bildene som er oppnådd.
    3. Når de er kalibrert, lagrer du systemparametrene som er spesifikke for platemerket i instrumentdatabasen, og bruker dem på nytt for fremtidige datainnsamlinger.
    4. Plasser platen forsiktig med de forberedte prøvene på det oppvarmede stadiet i HCS-bildesystemet. Forsikre deg om at platen er ordentlig plassert og i riktig retning for avbildning på mikroplateholderen (dvs. finn etiketten merket A1 på Reader-trinnet, og roter deretter mikroplaten slik at plasseringen av brønn A1 samsvarer med hjørnet med klistremerket).
    5. Trykk forsiktig ned mikroplaten for å sikre at den hviler flatt mot scenen. Ujevn utjevning av platen i HCS-systemet kan føre til feil i bildeoppkjøpet.
    6. Etter at platen er på plass, trykk og hold nede Ctrl-tasten , og klikk deretter Ctrl-OK i dialogboksen Plate Load / Unload i programvaren.
  2. Velge bildeparametere
    1. I HCS-bildesystemet åpner du målaktiveringsmodus i Cellomics bioapplikasjonsgrensesnitt og oppretter en ny protokoll ved hjelp av tokanals oppsettprotokoll som er kompatibel med (a) kjernefysisk farging og (b) datainnsamling av DHE-fluorescenssonde. I den nåværende protokollen ble filtrene 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS og 386_BGS_RS brukt til henholdsvis (a) Hoechst 33342 kjernefysisk farging, (b) total ROS-produksjon og (c) påvisning av superoksidradikaler. Valget av disse filtrene ble drevet av den spesifikke overlappingen for utslippsegenskapene til hvert fargestoff (DAPI og DHE) som ble brukt som en del av denne protokollen.
      MERK: Navngivningskonvensjonen for filtre, for eksempel 386-23_BGRFRN_BGRFRN, refererer til eksitering av prøven med 386 nm lys med en 23 nm båndbredde, etterfulgt av et dikroisk filter som passerer blått (B), grønt (G), rødt (R), langt rødt (FR) og nær infrarødt (N) lys ved bestemte bølgelengdeområder og 386_BGS_RS refererer til et utslippsfilter som passerer BGS og RS-utslippsbølgelengdelys etter dikroisk.
    2. Angi målene for bildeinnsamlingsprosessen i programvareprotokollgrensesnittet, for eksempel 10x eller 20x forstørrelse, etter behov.
    3. Velg riktig objektiv forstørrelse avhengig av ønsket nivå av bildedetaljer og oppløsninger som er nødvendige for eksperimentet. Oppløsningen av hvert mål er imidlertid fast. Detaljer med høyere oppløsning vil gjøre det nødvendig å endre ut målet på plattformen. I den nåværende protokollen brukes et 20x, 0.45 NA-mål, som er en del av screeningplattformen med høyt innhold som brukes i denne protokollen.
      MERK: 20x-målet representerer en god avveining mellom bildeoppløsningsdetaljer og innsamlingshastigheten som er nødvendig for å fange opp ROS-endringer over tid. Høyere forstørrelsesmål kan velges (f.eks. 40X), men dette vil føre til økte anskaffelsestider.
    4. Angi eksponeringsinnstillingene for bildeopptakskameraet, for eksempel eksponeringstid, kamerabinning og z-stackintervall, i henhold til de spesifikke kravene i protokollen.
      MERK: Eksponeringstiden (ofte i millisekunder) varierer basert på signalstyrken og følsomheten til de spesifikke fluoroforene som brukes. Dette kan også variere noe fra eksperiment til eksperiment basert på fargestoffkonsentrasjon og fargekvalitet. I den nåværende protokollen er parametrene for oppkjøp fastsatt som følger - Target % - 35%, bildeoppkjøpsmodus - 1104 x 1104 (med 2x2 binning) og mål 20x, 0, 45 NA. Disse parametrene kan settes i henhold til de spesifikke eksperimentelle forholdene.
  3. Parametere for bildekonfigurasjon
    MERK: Når bildeparametrene er angitt, kan bildeinnsamlingsprosessen startes ved hjelp av programvaregrensesnittet.
    1. Parametere for bildeinnsamling
      1. Identifiser det primære sporingsobjektet av interesse (kjernen til cellene) ved hjelp av forskjellige algoritmer som er tilgjengelige i instrumentet (optikk - isodata, fast og trekant).
        MERK: Isodatametoden for identifisering og merking av det primære objektet brukes i denne protokollen.
      2. Segmenter objektet (hvis aktuelt) etter form eller intensitetsparameter.
      3. Valider primærobjektet basert på ønskede størrelses-, form- og intensitetsparametere som er unike for hver celletype.
      4. Deretter definerer du 'interesseområdet' (ROI) rundt dette primære objektet.
        MERK: Avkastningen er en nøkkelparameter for datainnsamling som definerer stedet der intensiteten av fluorescensfargestoffet identifiseres for å være konsistent og repeterbar på tvers av celletyper. ROI definerer nøkkelparametrene (for eksempel intensiteten til fargestoffet), som måles for hvert primære sporingsobjekt (dvs. en celle) i forskjellige kanaler i instrumentet. Avkastningen kan defineres i form av en sirkel eller ring rundt kjernen til hver celle. HCS-programvaren oppnår automatisk intensiteten til DHE-fluorescensfargemarkøren i kanal 2 innenfor grensen for avkastningen for hver celle som segmenteres og analyseres på en automatisert måte.
      5. Sett en sirkel på 20 μm rundt primærobjektet (kjernen). Avstanden på 20 μm ble valgt i denne studien basert på de omtrentlige størrelsene på de forskjellige cellelinjene som ble brukt i denne protokollen (HepG2, JHH-4 og HUH-7). 20 μm ringavkastningen rundt cellene oppnådde fluorescensintensiteten på en konsistent og repeterbar måte.
        MERK Nøkkelparameteren ved valg av avkastning er evnen til å dekke celleområdet tilstrekkelig; størrelsen på den sirkulære avkastningen avhenger av cellestørrelsen. Større celler kan kreve større avkastning og omvendt for mindre avkastning. Disse parametrene må bestemmes på forhånd for hver celletype og fluorescensfargestoff av interesse.
  4. Befolkningskarakterisering og utvalgte funksjoner som skal lagres
    1. Når de forskjellige innsamlingsparametrene er definert i HCS-bildeprotokollen, setter du HCS-systemet i datainnsamlingsmodus.
    2. Bildeopptaksparametrene for denne protokollen ble satt som følger: en skannegrense på 1000 celler / brønn, med et minimumskrav på 10 objekter (celler) per felt.
      MERK: Antall felt som ble vurdert for hver brønn ble bestemt basert på at det endelige celletallet nådde tallet 1000. HCS-systemet fortsetter å søke på forskjellige steder i brønnen til det oppnår målpopulasjonen på 1000 celler/brønn. Innsamlingshastigheten avhenger dermed av samløpet og det totale celleantallet som er tilstede i hver brønn på 96-brønnplaten. I gjeldende protokoll ble total- og gjennomsnittsintensiteten til kanal 2 (som representerer superoksidradikalene og total ROS-produksjon) samlet inn fra hver brønn for videre nedstrømsanalyser.
  5. Bildeopptak, -behandling og -analyse
    1. Etter å ha justert og fullført bildeinnsamlingsparametrene, start skanneprosessen for hver 96-brønnsplate.
      MERK: Cellomics CX7 imaging system muliggjør screening med høyt innhold og automatisert analyse av prøver av en rekke parametere, inkludert ROS-produksjon i celler på en høy gjennomstrømningsmåte. I tillegg til ROS-produksjonen er HCS-systemet i stand til å gi ytterligere verdifull informasjon om forskjellige parametere som cellemorfologi, subcellulær lokalisering og mange andre cellulære funksjoner av interesse. Når den er optimalisert for innsamling, tillater HCS-bildebehandlingsplattformen omfattende, kvalitativ og kvantitativ karakterisering av celleparametere på en robust måte.
    2. Etter at skanneprosessen er fullført, start View Analysis-programvaren og eksporter de forskjellige kvantitative dataparametrene i et .csv format for ytterligere analyse.
    3. Ved hjelp av tredjepartsprogramvare kopierer og limer du inn de ulike kvantitative verdiene av interesse for ytterligere nedstrømsanalyser.
      MERK: I den nåværende protokollen ble GraphPad Prism-programvaren brukt til å analysere DHE-intensitetsverdiene som respons på indusert oksidativt stress på grunn avH2O2- og menadioneksponeringer.
  6. Data og statistisk analyse
    1. Beregn gjennomsnittlig gjennomsnittlig intensitet av kanal 2 (som representerer de totale ROS-verdiene og superoksidradikaler).
      MERK: Alle eksperimentene for å beregne intensitetsverdiene ble gjentatt tre ganger med 6 replikater per tilstand på hvert doseringsnivå.
    2. Utfør enveis ANOVA- eller t-test for å måle forskjellene i intensitetsverdiene mellom ulike testforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dihydroethidium (DHE) er et superoksid-responsivt fluorescensfargestoff som gir spesifikk informasjon om de intracellulære ROS-tilstandene. DHE-fargestoff avgir egentlig blå fluorescens i cytoplasma. Ved interaksjon med superoksydradikaler omdannes det imidlertid til 2-hydroksyethidium, som avgir fluorescens i de røde bølgelengdene (>550 nm) (figur 1). DHE-fargestoff transporteres lett inn i cellene og kjernen. Fluorescensen som sendes ut, kan visualiseres med et fluorescensmikroskopioppsett som vanligvis er tilgjengelig i mange laboratorier. I den nåværende studien ble nytten av DHE-fargestoff på flere hepatocellulære karsinomcellelinjer - HUH7-, JHH4- og HepG2-celler som en sonde av ROS-artsgenerering testet på en screeningsplattform med høyt innhold. Cellene ble behandlet med to ROS-genererende midler - (a) hydrogenperoksid og (b) menadion i 30 minutter på en doseavhengig måte (se figur 2 og figur 3 for doseringsdetaljer) for å indusere oksidativt stress i cellene etterfulgt av DHE-fargestoffmerking i en 96-brønnsplate. Både H2O2 og menadion økte fluorescensintensiteten dramatisk i alle tre cellelinjer på en doseavhengig måte. Ved å bruke bildesegmenterings- og kvantifiseringsalgoritmene innenfor screeningplattformen med høy gjennomstrømning, ble intensiteten av ROS-indusert DHE-fluorescens kvantifisert i 1000 celler per brønn over seks replikater. Tre uavhengige replikater ble målt, og resultatene ble aggregert og analysert. Hoechst 33342 kjernefysisk flekk spiller en viktig rolle i å identifisere planet der de adherente cellene er tilstede i hver brønn. I tillegg kan 2-OH-E + og E + fluorescens detekteres i både kjernen og cytoplasma av de testede cellene, henholdsvis på screeningplattformen med høy gjennomstrømning (se figur 4).

Eksponering for H2O2 resulterte i en statistisk signifikant økning av ROS-indusert fluorescens over alle cellelinjene analysert på en doseavhengig måte (se figur 2; nederste panel). En slik doseavhengig respons ble imidlertid ikke sett ved menadioneksponering. Med menadion viste JHH4-cellelinjen en doseavhengig økning i fluorescerende intensitet, mens i HepG2- og HUH7-cellelinjer ble det bare observert en signifikant forskjell i fluorescensintensitet ved de høyere menadionkonsentrasjonene (se figur 3; nederste panel). Disse forskjellene i ROS-generasjonsresponser kan skyldes de forskjellige mekanismene for ROS-produksjon avH2O2og menadion. Mens H2O2 utløser ROS-dannelse i celler på en mer direkte måte (f.eks. Gjennom virkningen av antioksidantenzymer som peroksidaser og katalaser), antas menadion å generere ROS-arter på en indirekte måte gjennom indusert mitokondriell dysfunksjon. På grunn av den indirekte mekanismen for ROS-produksjon, kan DHE-fluorescens kreve mer tid til å manifestere seg med menadion. Disse funnene indikerer at ROS-avhengig DHE-fluorescens er følsom for varigheten av oksidative stresseksponeringer, konsentrasjon og celletyper. Optimalisering av den eksperimentelle protokollen for hver unike celletype er derfor et must. Enda viktigere, denne protokollen demonstrerer muligheten for bruk av DHE-fargestoff som et ROS-deteksjonsmiddel på en høy gjennomstrømningsmåte, som er til nytte på områder som toksikologi, kreftbiologi og legemiddelscreening.

Figure 1
Figur 1: Et skjema som illustrerer veiene for oksidativ omdannelse av DHE-fluorescensmolekyl til henholdsvis 2-hydroksyethidium (2-OH-E+) og ethidium (E+). Fluorescensutslippsspektrene til 2-OH-E + og E + overlapper ved en eksitasjon på 480 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Hydrogenperoksidbehandling øker intracellulære ROS-nivåer på en doseavhengig måte. Hepatocellulære karsinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 ble behandlet medH2O2i doser på 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM i en periode på 30 minutter. Cellene ble farget med DHE (10 μM) fargestoff i kulturmedier i ytterligere 30 minutter, etterfulgt av Hoechst 33342 kjernefysisk farging. Totalt 1000 celler ble talt i hver brønn. En lineær, doseavhengig økning i DHE-fluorescens observeres over alle tre cellelinjer (topppanel). Statistisk signifikante økninger i fluorescens er sett i alle cellelinjer for dosering 500 μM og over (nederste panel). Hvert datasett er i gjennomsnitt seks replikater i en 96-brønnsplate hentet fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Behandlingsbetingelser ble sammenlignet med ubehandlede prøver med enveis ANOVA-test (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; bildeskala bar - 50 μm) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Menadionbehandling øker intracellulært ROS på en doseavhengig måte. Hepatocellulære karsinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 ble behandlet med menadion i doser på 25 μM, 50 μM, 75 μM og 100 μM i en periode på 30 minutter. Cellene ble farget med DHE (10 μM) fargestoff i kulturmedier i ytterligere 30 minutter, etterfulgt av Hoechst 33342 kjernefysisk farging. Totalt 1000 celler ble talt i hver brønn. En lineær, doseavhengig økning i DHE-fluorescens observeres over alle tre cellelinjer (topppanel). Statistisk signifikante økninger i fluorescens ses konsekvent for maksimal dose (100 μM; bunnpanel). Variabilitet er observert for de resterende dosene av menadion på tvers av forskjellige cellelinjer (JHH4 > HUH7 > HepG2). Hvert datasett er i gjennomsnitt seks replikater i en 96-brønnsplate hentet fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Behandlingsbetingelser ble sammenlignet med ubehandlede prøver med enveis ANOVA-test (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; bildeskala bar - 50 μm) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Enkeltcellet DHE-fluorescens - Et nærbilde av DHE-fluorescensforandringene observert etter behandling med (A) hydrogenperoksid og (B) menadion i en varighet på 30 minutter. Cytoplasmatiske og nukleære endringer av DHE-fluorescens observeres i de forskjellige cellene. Den automatiske segmenteringsmasken generert av screeningplattformen med høyt innhold ses også. Bildeskala bar - 10 μm. Forstørrelse - 20x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Avbildning av superoksiddrevet HE-fluorescens som respons på hydrogenperoksid. Hepatocellulære karsinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 ble behandlet medH2O2i doser på 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM i en periode på 30 minutter. Cellene ble deretter farget med DHE (10 μM) fargestoff i kulturmedier i ytterligere 30 minutter. Deretter ble celler opplyst med 386 nm LED, og fluorescensavbildning samlet ved >560 nm. Ingen kjernefysisk motfarging ble gjort for å unngå spektral krysstale. En doseavhengig økning i DHE-fluorescens observeres ved doser > 500 μM. UV-belyst DHE-fluorescens forventes å skyldes størstedelen av superoksidradikalproduksjonen. Hvert datasett er i gjennomsnitt seks replikater i en 96-brønnsplate hentet fra to uavhengige eksperimenter (n = 2). Behandlingsbetingelser ble sammenlignet med ubehandlede prøver med enveis ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; bildeskala bar - 50 μm) Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Avbildning av superoksiddrevet DHE-fluorescens som respons på menadione - Hepatocellulære karsinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 ble behandlet med menadion i doser på 25 μM, 50 μM, 75 μM og 100 μM i en periode på 30 minutter. Cellene ble deretter farget med DHE (10 μM) fargestoff i kulturmedier i ytterligere 30 minutter. I likhet med hydrogenperoksid ble det observert en doseavhengig økning i DHE-fluorescens. Hvert datasett er i gjennomsnitt seks replikater i en 96-brønnsplate hentet fra to uavhengige eksperimenter (n = 2). Behandlingsbetingelser ble sammenlignet med ubehandlede prøver med enveis ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; bildeskala bar - 50 μm) Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien ble en protokoll for å vurdere superoksiddrevet intracellulær reaktiv oksygenart (ROS) produksjon ved bruk av dihydroethidium (DHE) fluorescensfargestoff etablert på et screeningssystem med høyt innhold. Et flertall av de nåværende protokollene som er tilgjengelige i litteraturen, bruker DCFH-DA som en fluorescensavbildningssonde for å kvantifisere ROS-arter. Imidlertid har flere studier vist at DCFH-DA ikke er en ideell sonde for måling av intracellulær ROS. Ulike årsaker postulert for uegnetheten til DCFH-DA som en sonde inkluderer - (i) DCFH-DA utviser ikke en direkte reaksjon med H2O2, noe som gjør det til et upassende fargestoff for evaluering av det intracellulære H2O2 nivået. (ii) Flere en-elektronoksiderende arter, som OH., NO2. og ONOO-, oksiderer DCFH til DCF. (iii) overgangsmetaller, cytokrom c og hemeperoksidase kan fremme DCFH-oksidasjon i nærvær av oksygen ogH2O2. (iv) Viktigst produserer DCFH-DA mellomproduktet DCFH.- / DCF., som i nærvær av oksygen induserer produksjonen av ekstra superoksid. Dismutasjon med O2.- genererer ytterligere H2O2, noe som kan resultere i en kunstig økning av fluorescensintensiteten og feilaktig forhøyede ROS-nivåer. Flere forfattere har ansett bruken av DCFH-DA som en upålitelig fluorescerende sonde for påvisning av intracellulær H2O2 og andre ROS-arter 8,9,10,11,12,13,14.

I motsetning til DCFH-DA reagerer DHE spesifikt med superoksidradikalet, noe som fører til generering av et fluorescerende produkt, 2-hydroksyethidium (2-OH E +). Ikke-superoksid ROS-arter kan også reagere med DHE for å generere et andre fluorescerende produkt, ethidium (E +). Mens fluorescensspektrene til 2-OH-E + og E + er relativt like, representerer disse to molekylene sluttproduktene av de spesifikke interaksjonene mellom de intracellulære ROS-artene og DHE og er ansvarlige for den totale fluorescensintensiteten observert i cellene på grunn av oksidativt stress. Noen studier har indikert selektiv eksitasjon ved kortere UV-område bølgelengder (<400 nm) kan være mer spesifikk for 2-OH ethidiumeksitasjon (i motsetning til E +) og dermed superoksidradikalproduksjon 7,12,14. Dette ble vurdert ved å begeistre cellene med 386 nm LED-lys alene. I forhold til bølgelengdeeksitasjonen på 480 nm ble det observert en redusert intensitet av utslipp ved 560 nm bølgelengde (se tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2). Imidlertid kan man ikke være sikker på at dette utelukkende skyldes 2-OH Ethidiumfluorescens alene og representerer en potensiell mangel ved den nåværende tilnærmingen. Andre studier har vist UV-eksitasjon (f.eks. 386 nm) kan også resultere i samtidig utslipp av ethidiumfluorescens, om enn ved lavere nivåer sammenlignet med 2-OH ethidium 7,15. Uansett etablerer protokollen vår DHE som et bedre fargestoffalternativ for å måle de kvantitative forskjellene i flertallet av intracellulær ROS-produksjon ved hjelp av et bilde- og screeningssystem med høyt innhold.

Mangelen på mellomliggende drivere for ROS-generering (som de som er sett i DCFH-DA) antas å være en stor fordel ved bruk av DHE for å evaluere intracellulær ROS-produksjon. Imidlertid er denne mekanismen for DHE-fluorescens ikke fast etablert ennå. I tilfeller der nøyaktig kvantifisering av ROS-nivåene er nødvendig, anbefales det å bruke ytterligere ortogonale metoder for kvantitativ validering som HPLC og / eller væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) metoder for nøyaktig å estimere nivåene av 2-OH-E + i cellene 8,9,13. Imidlertid må man være oppmerksom på at HPLC- og LC-MS-metoder nødvendigvis innebærer aggregering og oppløseliggjøring av cellene for evaluering. Dermed vil den spatio-temporale informasjonen kodet i en fluorescensbasert bildebehandlingsmetode som i den nåværende protokollen gå tapt i HPLC og LC-MS og representerer en stor fordel ved bildebaserte ROS-vurderingsmetoder. En ekstra fordel med den rødforskjøvede fluorescensen av DHE er at lyset med lengre bølgelengde (i rødt) er mindre giftig for celler på grunn av den lavere energien som bæres av rødt lys.

Den doseavhengige naturen til DHE-fluorescens for å måle de relative intracellulære ROS-endringene ble testet ved bruk av menadion og hydrogenperoksid som oksidative stressindusere. Menadione og hydrogenperoksid ble valgt som teststoffer på grunn av de variable mekanismene for ROS og oksidativ stressgenerering20,21. Mens ROS-produksjon på grunn av menadioneksponering er indirekte (gjennom mitokondriell dysfunksjon), produsererH2O2oksidativt stress på en mer direkte måte. Økende konsentrasjoner av menadion førte til forbedret DHE-fluorescensproduksjon på en lineær, repeterbar og doseavhengig måte. I likhet med menadione er H2O2 en velkjent induktor av ROS som er i stand til å generere hydroksylradikaler (OH.) gjennom Fenton-kjemi på en direkte måte22. En lineær og doseavhengig respons ble tilsvarende observert ved HE-fluorescens på grunn avH2O2-eksponering. På grunn av selektiviteten til DHE for superoksydradikalet spesielt, reagerer det ikke direkte med H2O2. I stedet reagerer de intracellulære superoksydradikalene som produseres i utgangspunktet med H2O2 for å danne sekundære ROS-arter, slik som hydroksyradikaler via Haber-Weiss- og Fenton-reaksjonene, som deretter detekteres av DHE-fluorescens23. Fluorescensutslippsspekteret til DHE som respons på to forskjellige oksiderende stoffer ved å måle flertallet av intracellulær ROS-produksjon er etablert i gjeldende protokoll 8,13. Disse resultatene etablerer nytten av fluorescerende DHE-fargestoff som et bedre alternativ for deteksjon og kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer ved bruk av screening-tilnærminger med høy gjennomstrømning.

Den overlegne selektiviteten, følsomheten og optiske egenskapene til DHE gjør det til et verdifullt alternativ for å undersøke ROS-produksjon og oksidativ skade på en høy gjennomstrømningsmåte, som etablert i gjeldende protokoll. Fremtidige studier i laboratoriet vårt vil utforske DHEs rolle som en ROS-markør i kryssreaktiviteten mellom ROS og cellulære signalmekanismer under ulike fysiologiske og patologiske forhold i en høy gjennomstrømningsinnstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

RK og RRG ble støttet av et tilskudd fra UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) gjennom NIH NIGMS grant P20 GM130422. RRG ble støttet av en pilotpris fra NM-INSPIRES P30 grant 1P30ES032755. Bildekjernestøtten for CX7 Cellomics-instrumentet ble gitt gjennom AIM-senterkjernene finansiert av NIH-tilskudd P20GM121176. Vi vil gjerne takke Dr. Sharina Desai og Dr. Li Chen for deres uvurderlige hjelp med tekniske problemer knyttet til bruken av CX7 Cellomics bildebehandlingsplattform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes  VWR  20170-038 
96- well plate  Corning Costar  07-200-90 
Cellomics Cx7 ThermoFisher  HCSDCX7LEDPRO
Collagen  Advanced Biomatrix   5056 
DHE (Dihydroethidium)  ThermoFisher  D1168 
DMEM  Sigma   6046 
FBS  VWR  97068-085 
GraphPad Prism GraphPad Version 6.0
HepG2 cell line ATCC
Hoechst  ThermoFisher  33342 
HUH7 cell line ATCC
Hydrogen Peroxide  Sigma  88597 
JHH4 cell line ATCC
Menadione  Sigma  M5625 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
  2. Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
  3. Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
  4. Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
  5. Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
  6. Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
  7. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  8. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  9. Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  10. Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
  11. Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
  12. Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
  13. Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
  14. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
  15. Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
  16. Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
  17. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  18. Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
  19. Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
  20. Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
  21. Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
  22. Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
  23. Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).

Tags

Bioteknologi utgave 203 reaktive oksygenarter dihydroethidium høy gjennomstrømningsscreening hepatobiliær kreft diabetes toksikologi fluorescensfargestoffer
High Throughput Screening Vurdering av reaktive oksygenarter (ROS) generasjon ved bruk av Dihydroethidium (DHE) fluorescens fargestoff
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, R., Gullapalli, R. R. High… More

Kumar, R., Gullapalli, R. R. High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye. J. Vis. Exp. (203), e66238, doi:10.3791/66238 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter