Summary
В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.
Abstract
Ретинопатия является одной из основных причин слепоты во всем мире. Исследование ее патогенеза имеет важное значение для ранней диагностики и своевременного лечения ретинопатии. К сожалению, этические барьеры препятствуют сбору доказательств от людей. Недавние многочисленные исследования показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут быть дифференцированы в органоиды сетчатки (РО) с использованием различных протоколов индукции, которые имеют огромный потенциал в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток. В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции для генерации нейронной сетчатки (NR), который значительно снижает вероятность везикуляции и слияния, увеличивая вероятность успеха продукции до 60-го дня. Основываясь на способности ПСК к самореорганизации после диссоциации, в сочетании с определенными комплементарными факторами, этот новый метод может специфически стимулировать дифференцировку NR. Кроме того, этот подход является несложным, экономически эффективным, демонстрирует значительную повторяемость и эффективность, представляет обнадеживающие перспективы для персонализированных моделей заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный резервуар клеток для таких применений, как клеточная терапия, скрининг лекарств и тестирование генной терапии.
Introduction
Глаз служит основным источником информации среди органов чувств человека, а сетчатка является основной зрительной сенсорной тканью в глазах млекопитающих1. Ретинопатия является одной из основных глобальных причин заболеваний глаз, приводящих к слепоте2. Около 2,85 миллиона человек во всем мире страдают от различных степеней нарушения зрения, вызванных ретинопатией3. Следовательно, изучение его патогенеза имеет решающее значение для ранней диагностики и своевременного лечения. Большинство исследований ретинопатии человека были в основном сосредоточены на животных моделях 4,5,6. Однако сетчатка человека представляет собой сложную, многослойную ткань, состоящую из различных типов клеток. Традиционные двумерные (2D) системы клеточных культур и животных моделей, как правило, не в состоянии точно воспроизвести нормальное пространственно-временное развитие и метаболизм лекарств в сетчатке естественного человека 7,8.
В последнее время технологии 3D-культивирования позволяют создавать тканеподобные органы из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК)9,10. Органоиды сетчатки (РО), полученные из человеческих ПСК в системе 3D-суспензионных культур, не только содержат семь типов клеток сетчатки, но и демонстрируют отчетливую стратифицированную структуру, аналогичную сетчатке человека in vivo 11,12,13. ОО, полученные из ПСХ человека, завоевали популярность и широкую доступность и в настоящее время являются лучшими моделями in vitro для изучения развития и заболевания сетчатки человека14,15. За последние несколько десятилетий многочисленные исследователи продемонстрировали, что человеческие ПСК, включая эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), могут дифференцироваться в ОО с помощью различных протоколов индукции. Эти достижения обладают огромным потенциалом в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток 16,17,18.
Однако генерация нервной сетчатки (НР) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) является сложным, громоздким и трудоемким процессом. Кроме того, вариации тканевых органоидов от партии к партии могут привести к снижению воспроизводимости результатов19,20. Многочисленные внутренние и внешние факторы могут влиять на выход органоидов сетчатки (РО), такие как количество или виды исходных клеток и использование транскрипционных факторов и низкомолекулярных соединений 21,22,23. С тех пор, как в лаборатории Сасаи был создан первый человеческий ОО11, на протяжении многих лет было предложено множество модификаций для повышения простоты и эффективности процесса индукции 13,21,24,25. К сожалению, на сегодняшний день не установлено золотого стандарта для получения ПВ во всех лабораториях. Действительно, существует определенная степень расхождения в ОК в результате различных методов индукции, а также широкий разброс экспрессии маркеров сетчатки и надежности их структуры22,26. Эти проблемы могут серьезно осложнить сбор образцов и интерпретацию результатов исследования. Таким образом, необходим более консолидированный и надежный протокол дифференциации для достижения максимальной эффективности при минимальной гетерогенности генерации обратного осмоса.
В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции, основанный на комбинации Kuwahara et al.12 и Döpper et al.27 с подробными инструкциями. Новый метод значительно снижает вероятность органоидной везикуляции и слияния, повышая успешность генерации НР. Эта разработка имеет большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и клеточной терапии при заболеваниях сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по институциональной этике Китайской больницы общего профиля НОАК. Линейка ESC WA09 (H9) была получена от научно-исследовательского института WiCell.
1. Приготовление питательных сред и реагентов
- Питательная среда для ЭСК человека и раствор для пассажа
- Поддерживающая среда (ММ): Приготовьте 500 мл полного ММ (базальная среда + 5-кратное дополнение; см. Таблицу материалов) асептически. Разморозьте добавку 5 раз при комнатной температуре (RT) или на ночь при температуре 2-8 °C. Подогрейте до RT. Хорошо перемешайте перед использованием, пока добавка не перестанет мутнеть.
- 1% внеклеточный матрикс (ВКМ): Используйте предварительно охлажденный наконечник пипетки и стерильные пробирки для дозирования 200 мкл ВКМ (см. Таблицу материалов) на пробирку на льду. Храните пробирки в морозильной камере при температуре -20 °C. Растопите ECM на льду и разбавьте предварительно охлажденным DMEM/F12 в соотношении 1:100.
- 0,5 мМ рН = 8,0 ЭДТА: Чтобы приготовить 500 мл 0,5 мМ ЭДТА, добавьте 500 мкл 0,5 М ЭДТА и 0,9 г NaCl к 500 мл 1x фосфатно-солевого буфера (DPBS) Dulbecco (см. Таблицу материалов). Тщательно перемешайте и храните при температуре 2-8 °C.
- Дифференцировочная среда сетчатки
- Химически определенная среда без фактора роста (gfCDM): Приготовьте gfCDM, смешав 45% модифицированного среднего GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) от Iscove, 45% F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) от Ham, 10% заменителя нокаутной сыворотки (KSR), 1% концентрата холестериновых липидов и 450 мкМ тиоглицерина (см. Таблицу материалов).
- Низкомолекулярные соединения
- Y-27632 2HCl: добавьте 50 мг порошка Y-27632 к 3,122 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Дозируйте и храните Y-27632 (см. Таблицу материалов) в концентрации 50 мМ при -80 °C в течение 2 лет, вдали от света. Разбавьте буфет в 2 500 раз (20 мкМ) для использования, что эквивалентно 0,4 мкл Y-27632 на мл gfCDM.
- IWR1-endo: Добавьте 2,4424 мл ДМСО для растворения 10 мг IWR1-эндо (см. Таблицу материалов) для получения исходного раствора 10 мМ. Дозируйте аликвоты и храните их при температуре -80 °C до 2 лет. Добавьте 0,3 мкл 10 мМ IWR1-эндо на мл gfCDM для концентрации 3 мкМ для индукции.
- SB431542: Для приготовления 50 мМ SB431542 добавьте 10 мг SB431542 (см. таблицу материалов) к 0,5203 мл ДМСО и тщательно перемешайте. Хранить при температуре -80 °C в растворителе не более 2 лет. Для приготовления SB431542 при рабочей концентрации 10 мкМ добавляют 2 мкл исходного раствора 50 мМ к 10 мл гфМДМ.
- LDN-193189 2HCl: Растворите 5 мг LDN-193189 2HCl (см. таблицу материалов) в 10,4297 мл DMSO, чтобы получить 1 мМ исходного раствора. Хранить при температуре -20 °C или -80 °C (в соответствии с рекомендациями производителя). Добавьте 0,1 мкл материала на каждые 10 мл gfCDM, в результате чего получится 100 нМ LDN-193189 для индукции.
- Рекомбинантный костный морфогенетический белок человека 4 (BMP4): восстанавливается при концентрации 50-200 мкг/мл в 4 мМ HCl (см. таблицу материалов). Хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 1 месяца или -20 °C в течение 1 года после восстановления. Выполните индукцию NR с помощью BMP4 1,5 нМ.
- Питательная среда с длительным сроком действия NR
- Ретиноевая кислота (РА): Отмерьте 6 мг порошка РА (см. Таблицу материалов) и добавьте к 3,9941 мл ДМСО. Хранить в аликвотах по 5 мМ при −80 °C и использовать в течение 3 месяцев. Для достижения рабочей концентрации 0,5 мкМ добавьте 10 мкл мастер-смеси к 100 мл среды для дифференцировки нервной сетчатки (NRDM). Добавляйте непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите вдали от света во время приготовления и хранения. - Таурин: Добавьте порошок таурина (см. Таблицу материалов) массой от 200 мг до 7,9904 мл ДМСО для получения исходного раствора 200 мМ. Дозировать и хранить при температуре 2-8 °C. Рабочая концентрация таурина 0,1 мМ достигается путем добавления 50 мкл исходного раствора на 100 мл NRDM.
- NRDM: Составьте NRDM с DMEM/F12-GlutaMAX medium, 1% добавкой N2, 10% фетальной бычьей сывороткой, 0,5 мМ RA и 0,1 мМ таурина (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре 2-8 °C до 2 недель или 6 месяцев при -20 °C, чтобы обеспечить активность компонентов.
- Ретиноевая кислота (РА): Отмерьте 6 мг порошка РА (см. Таблицу материалов) и добавьте к 3,9941 мл ДМСО. Хранить в аликвотах по 5 мМ при −80 °C и использовать в течение 3 месяцев. Для достижения рабочей концентрации 0,5 мкМ добавьте 10 мкл мастер-смеси к 100 мл среды для дифференцировки нервной сетчатки (NRDM). Добавляйте непосредственно перед использованием.
- Блокирующий буфер: Разбавьте 1:9 DPBS до получения 10% рабочего раствора для использования (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре -20 °C до 5 лет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все остальные процедуры в шкафу биобезопасности класса II для обеспечения стерильности, за исключением взвешивания. Если в процессе приготовления необходимо добавлять взвешенные реагенты, используйте фильтры 0,22 мкм для фильтрации.
2. Культивирование H9-ESC
- Размораживание H9-ESC
- Добавьте 1 мл 1% ECM в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубируют в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5%CO2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте добавления ECM вдоль стенок скважины, так как он может прилипнуть к поверхности. - Возьмите криовиальный запас H9-ESC из резервуара с жидким азотом и быстро встряхните его в воде с температурой 37 °C в течение 30 секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте полного оттаивания флакона. - Извлеките флакон и тщательно простерилизуйте его с помощью 75% дезинфицирующего спиртового спрея. Добавьте размороженный H9-ESC из криовиала в пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл ММ с 10 мкМ Y-27632.
- Центрифугируйте пробирку при 190 × г в течение 5 мин при RT. Осторожно удалите большую часть надосадочной жидкости пипеткой объемом 1 мл, оставив примерно 50 мкл надосадочной жидкости, чтобы избежать потери клеток.
- Добавьте 1 мл MM, содержащего 10 мкМ Y27632, в клеточный осадок и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок с помощью пипетки объемом 1 мл, пипетируя вверх и вниз 5-10 раз.
- Снимите покрытие ECM через 1 ч инкубации. Добавьте в каждую лунку по 2 мл предварительно подогретого ММ, содержащего 10 мкМ Y-27632.
- Дозируйте 0,5 мл клеточной суспензии на лунку. Аккуратно встряхните пластину в стороны, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
- Инкубируйте планшет при 37 °C при 5%CO2 не менее 24 ч, не прикасаясь к нему.
- Меняйте носитель ежедневно. Когда плотность клонов достигает 70% и выше, требуется пассаж.
- Добавьте 1 мл 1% ECM в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубируют в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5%CO2 .
- Передача H9-ESC
- Подготовьте пластину с ECM-покрытием, как описано выше (шаг 2.1.1), и добавьте 2 мл MM на лунку.
- Извлеките отработанную среду из 6-луночных планшетов. Промойте каждую лунку дважды 1 мл DPBS.
- Промойте каждую лунку дважды, медленно добавляя 1 мл ЭДТА, и инкубируйте с 1 мл ЭДТА в течение 4-7 мин при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации исследуйте 6-луночный планшет в течение 3 мин под микроскопом. Немедленно переходите к следующему шагу, если большинство клеток близки к отделению от чашки. Избегайте длительной инкубации, чтобы уменьшить негативное воздействие на клетки. - Откажитесь от ЭДТА и добавьте 1 мл ММ, чтобы прервать пищеварение.
- Осторожно постучите по пластине лунки, пока большинство ячеек не отсоединится.
- Осторожно переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл. Осторожно суспендируйте колонии H9-ESC вверх и вниз 3-5 раз, чтобы перемешать их с пастеровской питеткой. Перенесите 20-100 мкл клеточной суспензии в новую 6-луночную чашку для культивирования, покрытую ECM, и встряхните ее вперед и назад.
- Когда плотность клеток будет признана достаточной под микроскопом, инкубируйте планшет при 37 °C при 5%CO2 не менее 24 ч, не прикасаясь к нему.
- Меняйте носитель ежедневно. При плотности клонов 70% и выше требуется пассаж.
3. Генерация НР человека
Примечание: Как только колонии достигнут примерно 70% слияния, они могут быть направлены на дифференцировку в органоиды сетчатки (RO) с помощью процедурных шагов, описанных на рисунке 1.
- День 0 - Формирование эмбриоидного тельца (БЭ)
- После промывки клеток 2 мл DPBS добавляют в лунку 0,5 мл CDS (см. таблицу материалов), содержащего 20 мкМ Y27632. Инкубируют в течение 3 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%СО2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом. Максимально сократите время инкубации, чтобы избежать вредного воздействия на клетки. - Прервите разложение, добавив 3 мл ММ, содержащего 20 мкМ Y27632. Центрифугу при 190 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл gfCDM, содержащей 20 мкМ Y27632, и подсчитайте количество клеток. Добавьте соответствующий объем для 1,2 × 106 ячеек (1,2 × 104 ячеек на лунку) к 10 мл gfCDM, предварительно включенной в 20 мкМ Y-27632, 3 мкМ IWR1-эндо, 10 мкМ SB431542 и 100 нМ LDN-193189 (см. таблицу материалов).
- Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку из 96 конических лунок с V-образным дном. Поместите планшет в увлажненный инкубатор с 5%СО2 до 6-го дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте посуду в течение как минимум 24 часов, чтобы улучшить соблюдение ЭБ.
- После промывки клеток 2 мл DPBS добавляют в лунку 0,5 мл CDS (см. таблицу материалов), содержащего 20 мкМ Y27632. Инкубируют в течение 3 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%СО2 .
- День 6 - Индукция сетчатки
- На 6-й день добавьте 10 мл gfCDM, содержащего 55 нг/мл BMP4, чтобы обеспечить полную смену питательной среды на ЭБ. Верните тарелку в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приложите пипетку к стенкам конического колодца с V-образным дном 96, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Избегайте попадания органоидов при смене среды. - Проводите полусреднюю смену на 9-й, 12-й и 15-й день. Замените половину среды свежим gfCDM, чтобы постепенно разбавить BMP4.
- На 6-й день добавьте 10 мл gfCDM, содержащего 55 нг/мл BMP4, чтобы обеспечить полную смену питательной среды на ЭБ. Верните тарелку в инкубатор.
- День 18 - Долгосрочная культура NR
- На 18-й день осторожно переложите сформированные БЭ в центрифужные пробирки объемом 15 мл с помощью пастеровских пипеток объемом 5 мл и снова осторожно промойте NRDM. Перенесите ЭБ на 6-луночные или 24-луночные планшеты с низкой адсорбцией (см. таблицу материалов). Верните тарелку в инкубатор.
- Заменяйте среду свежим NRDM каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выключайте свет во время смены среды, потому что RA чувствителен к свету. Удаляют плохо дифференцированные органоиды, а прилипшие органоиды отделяют под микроскопом.
4. Анализ НР человека
- Монтаж RO
- Выберите различные поколения H9-ESC для индуцирования трех партий RO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки успешности индукции для каждого из трех оцениваемых методов (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 и модифицированный метод в настоящем исследовании) рассчитываются три таблички с числом формирующих NR. Индукция считается успешной, если световая микроскопия выявляет образование нейроэпителиальноподобных структур на 30-е сутки.
- Выберите различные поколения H9-ESC для индуцирования трех партий RO.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание ОРК
- Переложите 3-5 ОО в пробирки по 1,5 мл. Удалите пипеткой излишки среды и промойте RO один раз 1 мл DPBS на RT. Дайте RO утонуть и осторожно извлеките DPBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида (см. Таблицу материалов) на пробирку объемом 1,5 мл и зафиксируйте при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: RO на 6-й и 18-й день, фиксируйте 2 ч. Закрепите за 12 ч на 30-й день и на 14 ч на 60-й день. - После фиксации обезвоживайте с помощью градиентного спирта. Оставьте RO на 15 минут каждый при 50%, 60% и 70% спирте, а затем на 10 минут каждый при 80%, 90%, 95%, 100% и 100% спирте. Затем добавьте смесь 100% спирта и ксилола в соотношении 1:1 в течение 10 минут, а затем ксилол дважды по 10 минут каждый.
- Поместите RO в металлические формы, заполненные расплавленным парапластом (см. Таблицу материалов), на 40 мин, а затем закалите формы на льду, чтобы зафиксировать RO. Поместите коробки для закладных в формы и заморозьте их при -20 °C на ночь. Впоследствии аккуратно отсоедините закладные коробки. Наконец, храните их на RT.
- Создавайте непрерывные срезы (толщиной 5 мкм) с помощью парафинового слайсера. Зафиксируйте срезы на предметных стеклах адгезионного микроскопа, высушите и храните в RT.
- Проводят депарафинизацию и регидратацию перед репарацией антигена12,27.
- Добавьте 10 мл 20-кратного раствора для извлечения цитратного антигена pH 6,0 (см. Таблицу материалов) к 190 мл ddH2O (двойная дистилляция H2O). Разогреть в микроволновке на сильном режиме 4 мин до закипания. После добавления парафиновых срезов нагрейте участки на низком уровне в течение 20 мин до завершения репарации антигена.
- Дайте парафиновым срезам остыть естественным образом в проветриваемом помещении, а затем поместите их во влажную камеру.
- С помощью ручки (см. Таблицу материалов) наметьте разделы. Инкубируют с 0,2% Triton X-100 при RT в течение 30 мин для разрушения мембран, после чего промывают предметные стекла три раза TPBS по 5 мин каждый.
- Блок с 10% ослиной сывороткой, разбавленной в DPBS при RT, в течение 1 ч во влажной камере из расчета 10 мкл на площадь окрашивания.
- Добавьте первичные антитела, разведенные в 10% ослиной сыворотке. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C во влажной камере. Трижды промывают образцы TPBS в течение 10 мин каждый, чтобы удалить несвязанные антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела: анти-PAX6 (1:250), анти-SOX2 (1:200), анти-KI67 (1:200), анти-CHX10 (1:200), анти-β тубулин III (1:250) и анти-NESTIN (1:200) (см. таблицу материалов). - Инкубируют со вторичными антителами, разведенными в DPBS, в течение 1 ч при РТ во увлажненной камере. Повторите этап стирки с TPBS три раза по 10 минут каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить в темноте, чтобы предотвратить гашение флуоресцентных вторичных антител. Вторичными антителами являются Alexa Fluor 488, конъюгированный с антимышиным IgG и Alexa Fluor 568, конъюгированный с антикроличьим IgG в разведении 1:400 (см. таблицу материалов). - Инкубируют с DPBS, содержащим DAPI (1:500; см. таблицу материалов), в течение 10 мин при RT в темноте. Промыть три раза TPBS по 10 минут каждый.
- Капните соответствующее количество антифлуоресцентного герметика (см. Таблицу материалов) на предметное стекло и накройте накладками.
- Визуализируйте с помощью проточного количественного анализатора клеток тканей (см. Таблицу материалов) или аналогичного.
- После микроскопического анализа храните предметные стекла при температуре -20 °C в темноте.
- Переложите 3-5 ОО в пробирки по 1,5 мл. Удалите пипеткой излишки среды и промойте RO один раз 1 мл DPBS на RT. Дайте RO утонуть и осторожно извлеките DPBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида (см. Таблицу материалов) на пробирку объемом 1,5 мл и зафиксируйте при 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Графический обзор модифицированного протокола показан на рисунке 1. H9-ESC использовались для генерации RO, когда клетки были выращены до плотности 70%-80%. Одноячеистые суспензии H9-ESC в 96 конических лунках с V-образным дном агрегировались в 1-й день и к 6-м суткам образовывали хорошо очерченные круглые ЭБ. По мере увеличения времени культивирования объем БЭ постепенно увеличивался. На 30-е сутки отчетливо сформировались и утолщены нейроэпителиальные структуры при длительной дифференцировке НР.
Кроме того, модифицированный метод сравнивали с двумя другими методами (Kuwahara et al.12 и Döpper et al.27) для оценки его повторяемости и эффективности (дополнительный рисунок 1). В этом исследовании также отмечалось, что морфология БЭ в 1-й день после модифицированного метода была несколько хуже, чем при двух других методах. Однако нейроэпителиальные структуры, сформированные с помощью модифицированного метода, были более непрерывными на 18-е сутки (рис. 2). На 30-е сутки ранние НР, полученные с помощью модифицированного метода, были похожи по форме и размеру и имели правильную круглую форму (рис. 3). По сравнению с двумя другими методами, НР, образованные модифицированным методом, имели меньшую частоту везикуляции и адгезии. Кроме того, на основе H9-ESC успешность генерации NR с использованием модифицированного метода увеличилась до 87,39% с 26,9% и 69,24% для методов Kuwahara et al. и Döpper et al.12,27 соответственно (рис. 3M).
Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на залитых парафином участках НР для оценки экспрессии маркеров, связанных с развитием сетчатки (рис. 4). Результаты показали экспрессию человеческих генов, связанных с сетчаткой, в NR, полученных из H9-ESCs с использованием модифицированного метода. Первым появившимся подтипом клеток является ганглиозная клетка сетчатки, которая в основном накапливалась на базальной стороне NRs. Для идентификации аксонов ганглиозных клеток сетчатки использовали окрашивание TUJ1 (рис. 4I-L). Более того, маркеры клеток-предшественников сетчатки были обнаружены как во внутреннем (PAX6+), так и во внешнем (CHX10+) слоях (рис. 4A-H). Клетки, позитивные на маркер пролиферации KI67, были распределены во внешнем слое (рис. 4A-D).
Рисунок 1: Обзор схемы. Схематический обзор модифицированного протокола культивирования показывает добавление различных факторов в определенные моменты времени и репрезентативные изображения развития нервной сетчатки. SFEBq: бессывороточная плавающая культура эмбриоидных телоподобных агрегатов с быстрой реагрегацией; KSR: замена нокаутирующей сыворотки; gfCDM: химически определенная среда, не содержащая фактора роста; NRDM: среда дифференцировки нервной сетчатки; BMP4: костный морфогенетический белок 4.Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные светлопольные изображения органоидов сетчатки, полученные по трем различным протоколам на ранней стадии. В 1-й день только модифицированный метод не делал из БЭ (А,Е,И). На 6-е сутки БЭ сформировались всеми тремя методами (B,F,J). На 18-е сутки сформировалась ранняя нервная сетчатка, и среди трех методов индукции (C,G,K) была обнаружена различная морфология. На 21-е сутки нервная сетчатка, сгенерированная модифицированным методом, показала непрерывную нейроэпителиальную структуру (D,H,L). Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Зрелая 3D нейронная сетчатка в культуре суспензии на 30, 45, 60 сутки. На 30-е сутки нервная сетчатка сформировалась во всех трех методах (А,Е,I). Стрелками обозначены кистозные структуры в методе Kuwahara et al. (B). Белыми пунктирными прямоугольниками обозначена область адгезии и слияния органоидов друг с другом (D,F,H). Органоиды сетчатки, полученные с помощью модифицированного протокола, похожи по размеру и морфологии по сравнению с двумя другими методами (C, G, J, K, L). Масштабные линейки: 100 мкм (белый); 200 мкм (черный). Статистический график успешности индукции тремя методами с использованием H9-ESCs (M). Для проверки значимости был использован однофакторный дисперсионный анализ (столбцы погрешности показывают стандартную ошибку, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Характеристика нейронной сетчатки в модифицированном протоколе. Иммуноокрашивание нервной сетчатки на 6-й, 18-й, 30-й и 60-й день. Зеленые пятна предназначены для KI67 (пролиферирующие клетки), PAX6 (клетки-предшественники сетчатки) и NESTIN (нейральные стволовые клетки). Красные пятна предназначены для CHX10 (клетка-предшественник сетчатки), SOX2 (клетка-предшественник нейрона) и TUJ1 (ганглиозная клетка сетчатки). Масштабные линейки: 100 мкм (A, B, E, F, I, J); 200 мкм (C, D, G, H, K, L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Сравнение блок-схем для трех протоколов индукции органоидов сетчатки. SFEBq: бессывороточная плавающая культура эмбриоидных телоподобных агрегатов с быстрой реагрегацией; KSR: замена нокаутирующей сыворотки; gfCDM: химически определенная среда, не содержащая фактора роста; NRDM: среда дифференцировки нервной сетчатки; BMP4: костный морфогенетический белок 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Морфология эмбриоидного тела (БЭ), индуцированная методом Кувахараэт и др. Постепенное появление скоплений мертвых клеток наблюдалось вокруг БЭ после добавления BMP4 на 6-е сутки (A-D, черные стрелки). Большие морфологические различия наблюдались после 6-х суток (Э-Л), а некоторые БЭ были даже полностью инактивированы (Г,Л). ESC: эмбриональная стволовая клетка, PBMC: мононуклеарная клетка периферической крови, IPSC: индуцированная плюрипотентная стволовая клетка. Масштабные линейки: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Человеческие ОР могут пространственно и во времени повторять развитие сетчатки плода, а ранние ОР демонстрируют высокую степень сходства с сетчаткой плода на эквивалентных стадиях развития15. С точки зрения морфологии тканей и молекулярной экспрессии, человеческий обратный осмос, точно отражает фактический статус роста ткани сетчатки, предоставляя огромные и беспрецедентные возможности в области моделирования заболеваний, скрининга лекарств и регенеративной медицины. В настоящее время разработано несколько различных методов получения ПВ из ПСК человека in vitro, и в настоящее время ведутся постоянные модификации и оптимизации для дальнейшего повышения эффективности9. Лаборатория Сасаи впервые сообщила о генерации ОО, полученных из ПСК из ЭСКчеловека11. ЭСК человека сначала готовили в одноклеточные суспензии, а затем такое же количество клеток засевали в 96 конических лунок с V-образным дном, с быстрой агрегацией с образованием круглых ЭБ. Внешнее добавление ключевых сигнальных путей клеток способствовало образованию оптических везикул в БЭ, которые впоследствии созревали в ламинированные ОК в суспензионной культуре. NR содержит один тип глиальных клеток и шесть различных типов нейрональных клеток, представляющих многие аспекты развития сетчатки, такие как морфогенез клеток, дифференцировка нейронов и апикально-базальная полярность9. Несмотря на то, что только 10% агрегатов образовали структуру оптического стаканчика с двойными стенками, это стало важной вехой в эволюции производства более совершенных ОО11.
Впоследствии Zhong et al. представили новую альтернативу, в которой ИПСК сначала выращивались вблизи слияния, а затем подвергались химическому или механическому распаду на плавающие небольшие агрегаты13. Затем небольшие агрегаты образовывали БЭ в суспензионной культуре, которые отделялись отдельно от нижней части пластины, далее дифференцировавшись в нервном направлении. Zhong et al. продемонстрировали полностью ламинированную 3D-сетчатку с относительно хорошо развитыми внешними сегментами фоторецепторов, которые реагировали на световую стимуляцию. Этот метод требовал меньшей внешней регуляции сигнальных путей клеток и в основном выполнялся самостоятельно9. Третьей технологической революцией стало внедрение метода встраивания группойЛоу 25. Это включало в себя встраивание агрегатов hESC в ECM для формирования однопросветной эпителиальной структуры. После ферментативного диспергирования агрегаты выдерживали в суспензионной культуре с образованием зрелых ОО. Несмотря на то, что все три метода могут успешно индуцировать ПВ с сопоставимой структурой и функциями, крупномасштабные применения имеют недостатки, заключающиеся в том, что они отнимают много времени и трудозатрат из-за их высокой гетерогенности и низкой успешности23.
В дополнение к вышеупомянутым методам Kuwahara et al. предложили новый метод индукции, а именно метод снижения градиента ключевого фактора12. Они обнаружили, что NR может быть сгенерирован путем добавления BMP4 при убывающей концентрации, начиная с 6-го дня. Эта индукционная система использовала меньше внешних факторов для формирования ОС с повышенной однородностью размера и морфологии. Однако исследования показали, что сформированные БЭ были склонны к кистозным поражениям, а успешность индукции этого метода составляла примерно 40%12,28. Дёппер и др. модифицировали этот протокол для повышения вероятности успеха, комбинируя коммерческую среду с тремя низкомолекулярными ингибиторами на ранней стадии индукции для стабилизации EBs27. Напротив, клетки нервного эпителия сетчатки легче прикрепляются друг к другу, что требует отдельного культивирования каждого РО при длительном культивировании суспензии. Метод Дёппера и др. увеличивает осложнения и стоимость экспериментальных операций и не подходит для крупномасштабной индукции27. Оптимизированный протокол производства обратного осмоса повысил эффективность индукции. Данный модифицированный метод был сравнен с методами Kuwahara et al. и Döpper et al.
Это исследование показало, что методы Kuwahara et al. и Döpper et al. формировали БЭ с гладкими краями на 1-й день, в то время как современный модифицированный метод требовал относительно много времени для формирования БЭ, примерно до 6-го дня. Объем ЭБ, полученных по методу Кувахара и др., был больше, чем по методу Дёппера и др., а ЭК, полученные по методу Дёппера и соавторов, показали повышенную текучесть при потоке жидкости. Примечательно, что скопления мертвых клеток постепенно появлялись вокруг БЭ после добавления BMP4 на 6-й день при использовании метода Kuwahara et al. (дополнительный рисунок 2). К 18-му дню наблюдались значительные морфологические различия в БЭ по методу Kuwahara et al., а некоторые БЭ были полностью инактивированы (дополнительный рисунок 2). В методе Дёппера и др. большинство БЭ были округлыми и хорошо очерченными, и вокруг них было обнаружено лишь небольшое количество рассеянных мертвых клеток. Модифицированный метод формировал плотные и хорошо структурированные БЭ с незначительными морфологическими различиями, вокруг которых наблюдалось несколько мертвых клеток.
Более того, в этом исследовании также было обнаружено, что некоторые БЭ генерируют везикулы Kuwahara et al. на ранней стадии после переноса на 6-луночные планшеты, что приводит к неспособности образовывать ОО. Адгезия и слияние ОО происходили примерно на 40-й день, что значительно снижало полезность экспериментов. Система культивирования по методу Дёппера и соавторов является более сложной, требует большего количества рабочих этапов и более высоких затрат, чем метод Кувахара и соавторов. У большинства ОО по Döpper et al. также неизбежно развивались адгезии и слияния друг с другом. Модифицированный метод в этом исследовании успешно генерировал 3D NR in vitro , которые экспрессировали маркеры, связанные с сетчаткой человека, CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 и NESTIN. И большинство ОО по модифицированному методу были одинаковыми по размеру и морфологии, и очень мало везикул или спаек развивалось на поздних стадиях дифференцировки сетчатки.
По сравнению с двумя другими методами, новая система культивирования имела более простые операционные этапы и более низкие затраты. Критическим этапом модифицированного метода является добавление трех низкомолекулярных ингибиторов в среду и обеспечение того, чтобы пластина не перемещалась в течение первых шести дней для стабилизации структуры ЭБ. Движение пластин или любые манипуляции с клетками на ранней стадии могут повлиять на формирование БЭ. По сравнению с двумя другими методами, модифицированный метод не менял среду в 1-й день, а также снижал использование низкомолекулярных ингибиторов на 15-й день. Короче говоря, этапы работы модифицированного метода в определенной степени упрощаются, а стоимость эксперимента экономится при меньшем использовании сред и реагентов. Однако модифицированный метод по-прежнему не может решить общие проблемы современной системы органоидных культур. Кроме того, эффективность индукции ОО во многом зависит от качества и дифференцирующей способности гПСК. В данном исследовании была полностью рассчитана только эффективность генерации NR с использованием H9-ESC. Мы успешно индуцировали ОРВ в различных линиях ПСК с помощью нового метода в настоящем исследовании и достигли одинаковой эффективности индукции, включая H9, H1 и PBMC-iPSC. Статистической разницы в эффективности индукции между тремя клеточными линиями нет. В будущем необходимо провести дополнительные исследования для изучения эффективности индукции различных ПСК с использованием этого метода.
В заключение, оптимизированный протокол индукции сетчатки прост и недорог, обладает высокой повторяемостью и эффективностью, предлагает многообещающие персонализированные модели заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный источник клеток для клеточной терапии, скрининга лекарств и тестирования генной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
